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目的:本课题以左金丸为研究对象,在验证其对肝细胞癌药效学作用的基础上,探究左金丸是否通过调控PI3K/AKT及Wnt/β-catenin双通路发挥抗肿瘤作用,阐明其具体的分子机制,为左金丸抗肝癌作用提供理论依据。方法:研究分为体外药效学部分,体外作用机制部分及体内作用研究三部分:1.通过CCK-8法检测左金丸醇提物对人肝癌细胞Hep G2、BEL-7402、HCC-LM3细胞增殖活力的影响;筛选BEL-7402细胞系进行后续实验,药效学评价研究包括显微镜观察细胞形态,罗丹明标记Phalloidin/DAPI染色观查细胞骨架,台盼蓝拒染法、Calcein-AM/PI染色实验评价细胞增殖能力;流式细胞术以及Hoechst 33258染色评价并观察细胞凋亡及凋亡形态。2.采用JC-1检测BEL-7402细胞线粒体膜电位;采用Western blot法检测左金丸对BEL-7402细胞BCL-2家族相关蛋白,Caspase家族相关蛋白,NF-κB/i NOS-Cox-2通路相关蛋白,PI3K/AKT及Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达。3.建立鼠源H22肝癌细胞BALB/c小鼠荷瘤模型,以HCC治疗药物5-氟尿嘧啶作为阳性对照药物,统计小鼠一般情况、外观、瘤重及抑瘤率变化;通过HE染色观察小鼠移植瘤病理学改变,通过免疫组织化学法检测PCNA、Ki 67和CD31在移植瘤组织中的表达情况;通过ELISA法检测TNF-α、IL-2及AFP在小鼠血清中的含量,Western blot方法检测左金丸对移植瘤组织中PI3K/AKT及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平的影响。结果:1.体外药效学CCK-8结果表明左金丸对三种细胞系均产生抑制活性,其中BEL-7402对左金丸最为敏感;与对照组比较,左金丸对BEL-7402的细胞形态产生影响,罗丹明标记Phalloidin/DAPI荧光染色法结果显示左金丸改变了BEL-7402的细胞骨架。台盼蓝拒染法结果表明左金丸能显著降低BEL-7402细胞存活率;Calcein-AM/PI染色结果表明随着左金丸浓度的增加,活死细胞比例数量明显减少。流式细胞仪检测和Hochest33258染色进一步发现左金丸能够诱导BEL-7402细胞凋亡,出现了细胞凋亡的形态。2.体外作用机制中JC-1结果表明左金丸可通过降低BEL-7402细胞的线粒体膜电位诱导细胞凋亡;Western blot结果表明,与对照组比较,左金丸能增加p53蛋白表达,增加BCL-2家族蛋白中Bax、BAD表达,降低BCL-2、BCL-x L蛋白表达,增加细胞色素c蛋白表达,增加caspase-9、caspase-3蛋白表达,调控PARP的剪切诱导细胞凋亡;与对照组比较,左金丸对PI3K/AKT通路中p-PI3K和p-AKT的表达量降低,对Wnt/β-catenin通路中p-GSK-3β、Wnt3a、β-catenin和cyclin D1的蛋白表达降低,对NF-κB/i NOS-COX-2信号通路中NF-κB、i NOS、Cox-2蛋白表达降低,TNF-α表达量增加。3.体内药效学及作用机制结果显示,随着给药剂量的增加,左金丸对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用,抑瘤率逐渐增加;病理组织研究表明左金丸对移植瘤的组织形态产生一定影响,左金丸对移植瘤组织中PCNA、Ki67和CD31表达水平明显降低,并呈现剂量-效应关系;左金丸可有效升高血清中TNF-α和IL-2的表达量,降低AFP的表达量;左金丸治疗的移植瘤组织中PI3K/AKT（p-AKT、p-PI3K、p-GSK-3β）、Wnt/β-catenin（Wnt3a、β-catenin、cyclin D1）信号通路相关蛋白表达降低,Caspase-3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2、NF-κB蛋白表达降低。结论:1.左金丸在体外可明显抑制不同肝癌细胞的生长,其中对BEL-7402细胞抑制最为明显,并呈现剂量-效应关系,染色结果表明左金丸可以抑制BEL-7402细胞增殖并诱导细胞凋亡;2.左金丸可以对BEL-7402细胞PI3K/AKT及Wnt/β-catenin通路产生双重抑制作用,从而激活线粒体凋亡途径,诱导细胞凋亡;同时左金丸对NF-κB/i NOS-Cox-2通路蛋白产生抑制作用,使肝癌细胞异常增殖受阻发挥抗肝癌作用。3.左金丸体内可显著抑制组织细胞增殖并诱导肝癌细胞凋亡从而抑制移植瘤的生长,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT及Wnt/β-catenin信号通路有关。