目的：甲状腺癌是一种较常见的恶性肿瘤,乳头状甲状腺癌约占甲状腺癌的60%。乳头状甲状腺癌和甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿均表现为甲状腺内结节性肿块,早期临床表现相似。甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿为良性甲状腺病变,10～18%的良性甲状腺病变会转化成恶性病变。浸润和转移是导致甲状腺癌治疗失败和患者死亡的主要原因。因此,寻找乳头状甲状腺癌浸润和转移相关的分子标志非常重要。抑癌基因的失活被认为是肿瘤发生与演进过程中的重要机制。基因启动子区域CpG岛的甲基化是导致基因失活最常见的表观遗传机制。寻找可用于肿瘤诊断、浸润和转移判断及预测良性结节恶性变的表观遗传学分子标志已成为肿瘤研究的热点,以期为临床诊治提供理论依据。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和跨膜丝氨酸蛋白酶(transmembrane proteaseserine4, TMPRSS4)可以降解细胞外基质(extracellular matrix， ECM)中成分,促进肿瘤细胞的侵袭的和转移,而肿瘤的浸润和转移与患者愈后密切相关。组织因子途径抑制物-2(tissue factor pathway inhibitor-2, TFPI-2)可抑制TMPRSS和MMPs对ECM的破坏作用,从而抑制肿瘤的浸润和转移。TFPI-2基因具有典型的管家基因特征,在大多数人类组织中表达,但在起源于这些组织的肿瘤中,常因启动子区CpG岛高甲基化而表达降低或不表达,因此,TFPI-2基因被认为可能是肿瘤抑制因子。本研究拟应用结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和乳头状甲状腺癌组织标本及人乳头状甲状腺癌TPC-1细胞和人髓样甲状腺癌TT细胞为研究对象,探讨TFPI-2基因在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和乳头状甲状腺癌组织中的表达差异,探讨该基因启动子区甲基化状态对其表达的影响及在乳头状甲状腺癌转移中的作用。以期为甲状腺结节性疾病的鉴别诊断和乳头状甲状腺癌转移的判断提供表观遗传学标志,为甲状腺疾病良性结节恶性变的早期发现提供线索。本论文分三部分：第一部分甲状腺结节性疾病中TFPI-2的表达及其在乳头状甲状腺癌中与TMPRSS4和MMP-1表达的关系方法1.采用免疫组织化学技术检测30例结节性甲状腺肿、20例甲状腺腺瘤和40例乳头状甲状腺癌组织(淋巴结转移患者18例,无淋巴结转移者22例)中TFPI-2蛋白的表达情况及在40例乳头状甲状腺癌组织中TFPI-2、 TMPRSS4和MMP-1蛋白的表达情况,分析TFPI-2在三种不同甲状腺结节性疾病中蛋白表达差异及其在乳头状甲状腺癌中与TMPRSS4和MMP-1蛋白表达的相关性,分析乳头状甲状腺癌中TFPI-2、 TMPRSS4和MMP-1蛋白表达与淋巴结转移的关系。2.统计学分析：所有数据均经SPSS14.0软件进行统计分析,计数资料采用列联表分析(crosstabs)，相关性分析采用Spearman相关分析,检验水准为a=0.05。结果1.免疫组化结果显示：结节性甲状腺肿组织中TFPI-2蛋白的阳性表达率为83.3%,甲状腺腺瘤组织中TFPI-2蛋白的阳性表达率为65.0%,甲状腺乳头状癌组织中TFPI-2蛋白的阳性表达率为52.5%,组间相比差异有显著性,X2=7.221,P=0.027；TFPI-2蛋白在伴转移乳头状甲状腺癌组织中的表达低于无转移甲状腺乳头状癌组织中TFPI-2蛋白的表达,差异有显著性X2=4.821,P=0.028；TMPRSS4和MMP-1蛋白在伴转移乳头状甲状腺癌组织中的表达均高于无转移甲状腺乳头状癌组织中的表达,差异有显著性,X2值分别为4.835和6.852；P值分别为0.028和0.009。2.相关分析显示：乳头状甲状腺癌中TFPI-2蛋白与TMPRSS、MMP-1蛋白的表达均呈负相关关系,相关系数分别为-0.383和-0.339,相关系数检验P值分别为0.015和0.032。第二部分甲状腺结节性疾病中TFPI-2基因启动子区CpG岛甲基化状态及意义方法1.采用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation specific-polymerase chain reaction， MSP)方法检测30例结节性甲状腺肿、20例甲状腺腺瘤和40例乳头状甲状腺癌中TTFPI-2基因启动子区甲基化状态,分析结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和乳头状甲状腺癌中TFPI-2基因启动子区CpG岛甲基化状态与TFPI-2蛋白表达的关系,分析乳头状甲状腺癌中TFPI-2基因启动子区甲基化状态与淋巴结转移的关系。2.统计学分析：所有数据均经SPSS14.0软件进行统计分析,计数资料采用列联表分析(crosstabs),相关性分析采用Spearman相关分析,检验水准为a=0.05。结果1. MSP结果显示：结节性甲状腺肿组织中TFPI-2基因启动子区甲基化率为16.7%,甲状腺腺瘤组织中TFPI-2基因启动子区甲基化率为25.0%,乳头状甲状腺癌组织中TFPI-2基因启动子区甲基化率为50.0%。组间相比差异有显著性,X2=9.722,P=0.008。乳头状甲状腺癌(伴转移)组织中TFPI-2基因启动子区甲基化率为88.9%,乳头状甲状腺癌(无转移)组织中TFPI-2基因启动子区甲基化率为18.2%,组间相比差异有显著性,X2=19.798,P=0.000。2.相关分析显示：结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和乳头状甲状腺癌中TFPI-2基因启动子区CpG岛甲基化状态与TFPI-2蛋白表达均呈负相关关系,r分别为：-0.760、-0.545、-0.651,P值分别为：0.000、0.020、0.000。第三部分甲状腺癌细胞系中TFPI-2基因启动子区CpG岛甲基化状态及其对TFPI-2、TMPRSS4和MMPl表达的影响方法1.以人乳头状甲状腺癌TPC-1细胞和人髓样甲状腺癌TT细胞为研究对象,采用MSP检测5-氮杂胞苷(5-aza-deoxycytidine，5-aza-dc)处理与未处理组TPC-1和TT细胞中TFPI-2基因启动子区甲基化状态。2.采用Western blotting方法检测5-aza-dc处理与未处理组TPC-1和TT细胞中TFPI-2、TMPRSS4和MMP1的蛋白表达。分析5-aza-dc对TPC-1和TT细胞中TFPI-2基因启动子区甲基化状态的影响及甲基化状态与TFPI-2、 TMPRSS4和MMP1蛋白表达的关系。3.统计学分析：应用SPSS14.0统计软件进行统计学处理,计量资料采用(x±s)表示；计量资料采用两样本均数t检验。检验水准为α=0.05。结果1.MSP结果显示：甲状腺癌TPC-1和TT细胞中TFPI-2基因启动子区处于甲基化高状态,而5-aza-dc处理后TPC-1和TT细胞中TFPI-2基因启动子区呈去甲基化状态。2.Western blotting结果显示,5-aza-dc处理组TPC-1和TT细胞中TFPI-2蛋白表达织高于5-aza-dc未处理组,差异有统计学意义,t值分别为：32.704和18.432,P值分别为：0.000和0.000；而5-aza-dc处理组TPC-1和TT细胞中TMPRSS4和MMP1蛋白低于5-aza-dc未处理组,P值均小于0.01。结论1.TFPI-2基因启动子区CpG岛高甲基化可能是乳头状甲状腺癌中TFPI-2失活的重要机制2.TFPI-2基因启动子区CpG岛甲基化状态和TFPI-2蛋白表达可能是结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和乳头状甲状腺癌的鉴别诊断的重要分子标志。3.TFPI-2基因启动子区甲基化状态、TFPI-2、 TMPRSS4和MMP-1蛋白表达可能与乳头状甲状腺癌的转移存在密切的关系。4.TFPI-2在乳头状甲状腺癌转移中的作用可能与TFPI-2因基因启动子区高甲基化而表达降低,从而使MMP-1和TMPRSS4表达增高有关。5.TFPI-2可能成为检测良性结节恶性变的指示因子。本研究创新点：甲状腺癌的发病率不断上升,且部分良性结节会发生恶性变,但少有人关注。以结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤、乳头状甲状腺癌和甲状腺癌细胞系为研究对象,从组织和细胞培养等不同角度探讨了TFPI-2基因启动子区甲基化状态在乳头状甲状腺癌转移中的作用及其在乳头状甲状腺癌、结节性甲状腺肿和甲状腺腺瘤的鉴别诊断中的意义。为甲状腺结节性疾病的鉴别诊断和乳头状甲状腺癌转移的判断提供了新的表观遗传学标志物,为甲状腺疾病良性结节恶性变提供了早期检测的线索。