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第一部分地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤内皮细胞的保护作用目的了解缺氧/复氧(A/R)对人内皮细胞的损伤作用,和地氟醚预处理对内皮细胞的A/R损伤所起的保护作用。方法选用人脐静脉内皮细胞株(ECV304)。将细胞分为5组:空白对照组(C组),A/R组,A/R+肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10ng/ml)刺激组(A/R+TNF-α组),地氟醚1.0MAC预处理+A/R组(Des+A/R组),地氟醚1.0MAC预处理+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激组(Des+A/R+TNF-α组)。应用流式细胞仪碘化丙啶(PI)染色法、原位缺口末端标记(TUNEL)法、透射电镜(EM)观察法检测各组内皮细胞的凋亡和坏死。结果A/R组较对照组中的细胞凋亡和坏死率有一定增加;经TNF-α刺激后,A/R+TNF-α组的细胞凋亡和坏死率则显著增加;而经地氟醚预处理后,Des+A/R组、Des+A/R+TNF-α组细胞较相应无预处理的A/R组、A/R+TNF-α组,其细胞凋亡和坏死率有明显减少;透射电镜观察到,A/R组和A/R+TNF-α组,可见较多的细胞坏死现象:细胞肿胀、细胞内超微结构破坏,大量空泡出现,核染色质溶解或核碎裂、细胞膜破坏明显。而两组地氟醚预处理后的细胞结构正常,胞内有丰富的内质网和线粒体,核仁增多明显,细胞处于增殖和修复状态。结论地氟醚预处理可抑制内皮细胞缺氧/复氧引起的细胞死亡、减少细胞损伤、加强细胞修复和增殖,从而具有一定的保护作用。第二部分地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤内皮细胞中NF-κB转导通路的影响目的探讨预处理对内皮细胞NF-κB活性的影响;并进一步分析NF-κB信号通路中一系列关键转导蛋白表达的变化,以明确地氟醚预处理对内皮细胞A/R损伤所起保护作用的分子机制,为临床麻醉实施中预防缺血再灌注损伤的麻醉药物选择提供实验和理论依据。方法选用人脐静脉内皮细胞株(ECV304)。将细胞分为5组:空白对照组(C组),A/R组,A/R+肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10ng/ml)刺激组(A/R+TNF-α组),地氟醚1.0MAC预处理+A/R组(Des+A/R组),地氟醚1.0MAC预处理+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激组(Des+A/R+TNF-α组)。采用间接免疫荧光法检测各组细胞中NF-κB/p65亚基的定位;应用核浆分离技术和Western blot分析法检测NF-κB/p65亚基在各组细胞核内的蛋白表达水平;应用Western blot分析法检测各组细胞NF-κB信号途径中,κB抑制因子-α(IκB-α)的降解以及磷酸化IκB-α(p-IκB-a)、磷酸化IκB激酶α/β(p-IKKα/IKKβ)的表达;以肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)抗体免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)并用Western blot法检测各组细胞膜受体信号转导复合体中,TNFR1与肿瘤坏死因子受体相关因子2(tumor necrosis factor receptor-associatd factor 2,TRAF2)及IκB激酶α(IKKα)的蛋白结合水平;应用流式细胞术检测各组内皮细胞膜表面TNFR1的表达。结果间接免疫荧光分析法显示对照组细胞NF-κB/p65亚基免疫荧光标记分布于胞浆区;A/R组可见部分免疫荧光标记由胞浆区转入核区;经TNF-α刺激后,A/R+TNF-α组细胞的NF-κB/p65亚基免疫荧光标记几乎全部入核;而经地氟醚预处理后,Des+A/R组的免疫荧光标记入核较A/R组有明显减少;Des+A/R+TNF-α组的免疫荧光标记的入核亦较相应的A/R+TNF-α组有明显减少。应用核浆分离技术、Western blot分析法定量检测,进一步确证了免疫荧光分析法的结果。Western blot分析法检测各组细胞中IκBa含量,可见A/R组较对照组IκBα有一定减少;经TNF-α刺激后,可见显著减少;而经地氟醚预处理后,Des+A/R组较A/R组的IκBα有显著增加。同样,Des+A/R+TNF-α组则较相应未经预处理的A/R+TNF-α组有显著增加;而Des+A/R、Des+A/R+TNF-α组间无显著差异。同法,检测细胞中p-IκBα、p-IKKα/IKKβ含量。结果提示,A/R组细胞中三种关键转导蛋白含量均较对照组有一定增加;经TNF-α刺激后,A/R+TNF-α组中可见显著增加;而经地氟醚预处理后,Des+A/R组较A/R组中p-IκBα含量有显著减少;Des+A/R+TNF-α组亦较相应未经预处理的A/R+TNF-α组有显著减少。应用免疫共沉淀-Western blot法检测各组细胞TNFR1与TRAF2及IKKα的蛋白结合水平。可见A/R组细胞转导复合体中招募TRAF2蛋白及激活IKKα蛋白的含量较对照组有一定增加;经TNF-α刺激后,A/R+TNF-α组中可见显著增加;而经地氟醚预处理后,Des+A/R组较A/R组中所招募TRAF2及激活IKKα的蛋白含量有显著减少;Des+A/R+TNF-α组亦较相应未经预处理的A/R+TNF-α组有显著减少。应用流式细胞术检测了内皮细胞膜表面TNFR1的表达,可见未经处理的对照组细胞,其膜表面的TNFR1呈高表达;缺氧/复氧损伤后,受体表达没有明显变化;经TNF-α外源性刺激后,受体内吞显著加强,参与介导激活NF-κB信号转导通路;而经地氟醚预处理的后两组,分别与相对应的无预处理组比较,其膜表面TNFR1的表达无显著性差异;即使是经过地氟醚预处理的内皮细胞,其在外源性TNF-α刺激下,仍可见受体内吞有显著加强。结论A/R损伤可激活内皮细胞中NF-κB的活性,而地氟醚预处理可抑制这种由TNF-α介导的NF-κB信号通路的激活。这一调节作用可能是地氟醚预处理对内皮细胞缺氧/复氧损伤所起保护作用的分子机制之一。而地氟醚预处理对NF-κB信号通路产生抑制的始动作用位点,在于TNF膜受体信号转导复合体中对TNFR1对于TRAF2蛋白的招募,而非影响膜受体TNFR1本身的表达。第三部分地氟醚预处理对缺氧/复氧损伤时NF-κB转导通路效应分子的影响目的了解地氟醚预处理对内皮细胞A/R损伤时炎性介质分子和黏附分子表达的变化趋势,探讨预处理对于NF-κB信号转导通路激活后的效应分子的影响。方法选用人脐静脉内皮细胞株(ECV304)。将细胞分为5组:空白对照组(C组),A/R组,A/R+肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10ng/ml)刺激组(A/R+TNF-α组),地氟醚1.0MAC预处理+A/R组(Des+A/R组),地氟醚1.0MAC预处理+A/R+TNF-α(10ng/ml)刺激组(Des+A/R+TNF-α组)。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法分别检测各组细胞的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和白细胞介素-8(IL-8)的基因表达水平。结果对照组细胞中仅有少量ICAM-1、VCAM-1和IL-8 mRNA的表达;A/R组较对照组细胞的ICAM-1、VCAM-1和IL-8 mRNA表达水平均有所增加;经TNF-α刺激后,A/R+TNF-α组细胞的mRNA表达水平呈显著性增加;而经地氟醚预处理后,Des+A/R组细胞的mRNA表达较A/R组有明显降低;Des+A/R+TNF-α组亦较相应未经预处理的A/R+TNF-α组有显著性降低;而Des+A/R、Des+A/R+TNF-α组间无显著性差异。结论地氟醚预处理可抑制TNF-α刺激的内皮细胞表面黏附分子(如ICAM-1、VCAM-1)及炎性介质(如IL-8)的基因表达水平。