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广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.为广东道地药材,为唇形科刺蕊草属植物,其干燥地上部分入药,具有芳香化湿,开胃止呕,发表解暑的功效,是多种著名中成药“藿香正气丸”、“藿胆丸”等以及现代中药制剂“抗病毒口服液”的主要原料。广藿香生产中面临青枯病的危害,该病由青枯菌Ralstoniasolanacearum侵染所致,为典型的维管束病害,该病可在整个生长期发生,但以盛夏高温多雨季节发病最盛,青枯病为土传病害,一旦发生便迅速蔓延,连作的土地危害尤为严重,且青枯菌寄主范围广,存在交叉感染,病原菌变异大,生理分化复杂,使得广藿香迫切需要进行品种的改良和种质资源创新的工作。 本研究考察了青枯菌及其粗毒素对广藿香离体培养的影响;建立了以青枯菌粗毒素及培养的青枯菌为选择压力的离体筛选体系;在此基础上,将60Coγ射线辐照诱变与离体筛选相结合,开展了抗病无性系的筛选工作。 1.国内外研究评述 查阅了与本研究相关的国内外文献资料,总结了广藿香在种质资源、栽培技术、病虫防治、品种选育等方面的研究现状;介绍了青枯病病原菌的研究现状;阐述了抗青枯病育种的研究进展;并对植物抗病性筛选的方法进行了概述。 2.以青枯菌粗毒素为选择压力的离体筛选体系的建立 以广藿香试管苗叶片及带节茎等为材料,探讨了青枯菌粗毒素对广藿香离体培养的影响。结果表明:过滤灭菌法制备的青枯菌粗毒素致毒性比湿热灭菌法处理更强,外植体成活率明显降低;以培养12 h的青枯菌粗毒素对外植体有较大的致毒性,外植体变褐死亡现象较突出,培养30d后,叶片及带节茎出芽率分别为10.33%及36.11%;浓度在1.41?108 cfu?ml-1以上的菌液粗毒素对外植体有明显的抑制和毒害作用,大多外植体枯黑死亡,出芽率较低,同时在该浓度时,对无根苗也有明显毒害,大多数无根苗难以生根,同时植株基部变黑,叶片变黄,生长不良。 3.以培养的青枯菌为选择压力的离体筛选体系的建立 以广藿香试管苗叶片及带节茎等为材料,探讨培养的青枯菌对广藿香离体培养的影响。结果表明:在青枯菌培养基中加入一定体积比的NA液体培养基,用以考察培养的青枯菌对无根苗的致萎作用最简便易行;青枯菌浓度达到0.85 cfu?ml-1以上时,对无根苗的毒害作用明显;当青枯菌浓度为0.85 cfu?ml-1、1.02 cfu?ml-1、1.28 cfu?ml-1和1.70 cfu?ml-1时,叶片出芽率的影响差别较明显,对不带节茎和带节茎出芽的影响差别不明显。 4.辐射诱变与离体筛选相结合选择抗病无性系 以经过60Coγ射线辐照的广藿香的不同外植体为材料,在适合的青枯菌粗毒素压力下进行离体筛选,将辐照诱变与离体培养相结合进行抗病无性系的筛选研究。三次辐射诱变试验得到了部分可能具有抗性的再生芽;将再生芽接种至含有2.35?108 cfu?ml-1的青枯菌制备的粗毒素培养基上,获得44株抗性无根苗;进一步在浓度为3.52?108 cfu?ml-1的青枯菌制备的粗毒素培养基上筛选,获得12株抗青枯病粗毒素的无根苗。