生物体内绝大多数蛋白质必须经过正确折叠形成天然构象,才具有生物学活性。新生多肽有发生错误折叠的倾向,易形成具有潜在细胞毒性的聚集体形式。因此,对细胞或整个生物机体来说,维持体内蛋白质稳态是至关重要的。分子伴侣参与了蛋白质的翻译、折叠、展开、移位和降解等过程,其中,Dna K-DnaJ-Grp E(KJE)分子伴侣系统普遍存在动植物和微生物中并起着重要作用。作为该系统的关键组分,DnaJ的功能不济特别是在胁迫条件下可能无法有效避免错误折叠蛋白聚集,甚至被其扣留形成共聚集,从而引发由蛋白聚集带来的许多生物学问题,譬如包涵体形成、淀粉样肽相关的神经退行性疾病等。因而,对DnaJ进行分子改良特别是提高DnaJ的自身可溶性或许是强化其分子伴侣活性的重要途径。目前,基于增溶接头(特别是超酸性短肽)的融合基因表达策略已成为提高蛋白质可溶性和热稳定性的重要手段。因此,本工作以大肠杆菌DnaJ为研究对象,选取两种具有实效的超酸性短肽(ra3t和tua2)作为融合接头,构建DnaJ融合蛋白,并通过大肠杆菌重组表达分析接头对DnaJ可溶性及其分子伴侣活性的影响,取得的主要结果如下:1.载体构建(1)含分子伴侣基因的原核表达载体构建通过基因组PCR从大肠杆菌BL21(DE3)中分别得到Dna K(K)、DnaJ(J)和Grp E(E)全长基因,然后通过酶切插入到p ET32a(+)载体Nde I和Xho I位点之间,构建了K、J和E的原核表达载体p ET(K)、p ET(J)和p ET(E)。(2)DnaJ融合表达载体构建在p ET(J)的基础上,将超酸性短肽ra3t和tua2插入到DnaJ的N-端、C-端或两端,构建了一系列DnaJ的原核融合表达载体。(3)含靶蛋白基因的原核表达载体构建从已有靶蛋白的p ET载体中重新扩增出Jc APX1(APX1)、Ec MetA(MetA)、Jc TBP1(TBP1)、Nt RCA(RCA)和DnaJ(J)基因片段,通过重组克隆构建了其p ACYC184背景下的系列原核表达载体p AY(APX1)、p AY(MetA)、p AY(TBP1)、p AY(RCA)、p AY(J)。分别从烟草和花椰菜基因组中扩增出基因片段Ntrbc L(rbc L)和Bo WSCP(WCP),并从质粒p EGFP-N1扩增出基因片段EGFP(GFP),然后通过重组克隆进一步构建了原核表达载体p AY(rbc L)、p AY(WCP)和p AY(GFP)。2.KJE分子伴侣系统中DnaJ功能强化具有优先性重组Dna K和Grp E蛋白90%都在上清中,可溶性很高,而DnaJ的可溶性只有50%左右,表明KJE分子伴侣系统中对DnaJ的功能强化具有优先性。3.融合超酸性短肽可提高DnaJ的可溶性DnaJ融合超酸性短肽(ra3t和tua2)可提高它的可溶性,提高了至少1.4倍。4.共表达分析含分子伴侣基因的p ET系列载体与含靶蛋白基因的p AY系列载体可以在大肠杆菌中实现相容性共表达,从而评判分子伴侣对靶蛋白可溶性和活性的影响。(1)DnaJ融合超酸性短肽可进一步提高APX1的可溶性和酶活性DnaJ及其所有超酸性融合蛋白都可提高与它共表达APX1的可溶性,但C-端融合的作用最为显著,所以后续工作则围绕C-端融合DnaJ展开。同时,APX1胶活性染色和酶活测定结果表明,相对于单独DnaJ,超酸性融合DnaJ还可以更好地提高APX1的酶活性,且与对APX1可溶性的提高程度相一致,说明它确能帮助APX1形成具有正确折叠和功能的可溶性蛋白。(2)DnaJ融合超酸性短肽可进一步提高GFP的可溶性和荧光活性与单独DnaJ相比,超酸性融合DnaJ可进一步显著提高与它共表达GFP的可溶性,而且荧光激发结果显示它还能更大程度地提高GFP的荧光活性,这也表明它是能帮助形成具有正确构象的可溶性GFP。(3)DnaJ融合超酸性短肽可进一步提高MetA的可溶性及其共表达重组大肠杆菌的耐热性超酸性融合DnaJ相比单独DnaJ可进一步显著提高与它共表达MetA的可溶性。另外,细菌稀释点板实验发现,44℃高温胁迫下,MetA与超酸性融合DnaJ共表达的大肠杆菌菌株在M9基本培养基上的生长状况最好,表明超酸性融合DnaJ还能相对更好地提高与MetA共表达大肠杆菌菌株的耐热性。同样,这也在一定程度上说明超酸性融合DnaJ是能帮助形成具有正确构象和功能的可溶性MetA,从而赋予其重组大肠杆菌在基本培养基上更好的耐热性。(4)DnaJ融合超酸性短肽可进一步提高其它靶蛋白的可溶性与单独DnaJ相比,超酸性融合DnaJ还能进一步显著提高与其共表达的其它四种靶蛋白(rbcL、RCA、WCP、TBP1)的可溶性。5.DnaJ融合超酸性短肽可进一步提高非共表达重组大肠杆菌和酵母菌的耐热性细菌稀释点板实验显示,与DnaJ相比,在44℃高温胁迫下含超酸性DnaJ融合表达载体的大肠杆菌在LB平板上的菌落生长状况较好;同时,酵母稀释点板实验也发现,在51℃高温胁迫下含超酸性DnaJ融合表达载体的酵母重组菌在YPD平板上的菌落生长状况也更好;这表明DnaJ融合超酸性短肽能够提高它的通用分子伴侣活性,从而赋予其大肠杆菌和酵母重组菌株更好的耐热性。6.DnaJ融合超酸性短肽可提高其自身的可溶性DnaJ作为靶蛋白与超酸性融合DnaJ共表达时,其可溶性明显提高,至少提高了1.2倍,表明超酸性融合DnaJ还可以增强DnaJ自身的可溶性,可能也在一定程度上促进DnaJ的活性。总之,以上结果表明DnaJ仅仅简单融合超酸性短肽就可显著增强它的分子伴侣活性,相比自身能够更有效地提高靶蛋白的可溶性和活性,并赋予其重组大肠杆菌和酵母菌更好的耐热性。超酸性融合DnaJ比单独DanJ具有更高的可溶性,而且这种可溶性提高主要是由同种负电荷排斥作用所致,这样就能将更多与DnaJ相结合的靶蛋白带入可溶状态,不易形成聚集和共聚集,从而有利于靶蛋白的正确折叠。另一方面,DnaJ自身可溶性能够被高可溶的超酸性融合DnaJ提高,也有利于其分子伴侣活性的发挥。这两种机制或许共存,但可能以前者起主导作用。