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背景和目的结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)主要包括结肠癌和直肠癌,好发于直肠和乙状结肠。结直肠癌常见病理学类型是结直肠腺癌,可占总数的95%以上。结直肠癌已成为世界第三大新发和致死性癌症类型,近年来中国随着老龄化社会的到来和饮食结构的改变,结直肠癌发病率和死亡率逐年上升,严重威胁人类的健康。由于40%-50%的患者在初诊时已经发生了远处转移,即使接受了根治性手术,仍然有50%以上患者出现复发性转移,因此寻找结直肠癌转移过程中的关键蛋白可为结直肠癌治疗提供有效策略。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活物 1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α,PGC-1α)是过氧化物酶体增殖活化受体 γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARy)的转录共激活因子,它可以与多种核受体以及转录因子结合,参与多种生物学过程的调控,如能量代谢、产热等。代谢改变已成为肿瘤的核心标志之一,其与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞为了适应体内的高代谢需求,常常适应性增加线粒体代谢。PGC-1α作为线粒体代谢的重要调节因子,可以通过增强线粒体代谢产能以适应肿瘤细胞的高代谢需求。PGC-1α在肿瘤发生发展中的作用已有报道,引起我们注意的是,它在不同肿瘤中具有双重作用。目前关于结直肠癌中PGC-1α的作用报道局限于其对肿瘤生长的影响,并且研究结果具有争议,一方面研究报道PGC-1α可能影响线粒体代谢与脂肪酸代谢转换而促进肿瘤生长,另一方面研究表明其可能通过诱发细胞凋亡通路而抑制肿瘤生长。本研究前期组织芯片结果显示PGC-1α在结肠腺癌组织中高表达,且与淋巴结转移呈正相关,说明PGC-1α可能影响结直肠癌的转移。而血管生成是实体肿瘤细胞不断生长、侵袭和转移的必要前提,PGC-1α已被报道可调节正常肌肉和脉管系统的血管生成,但其在结直肠癌血管生成中的作用未知。基于此,本研究探讨PGC-1α在人结直肠癌细胞生长、迁移、侵袭及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移、侵袭和血管生成中的作用,为结直肠癌转移和血管生成治疗提供新的靶点和理论依据。方法1.免疫组织化学染色:利用组织芯片检测人结肠腺癌和癌旁组织中PGC-1α的蛋白表达差异,并分析其表达水平与临床病例资料的关系。2.蛋白质免疫印迹:检测人结直肠癌细胞系与正常结肠上皮细胞系中PGC-1α的蛋白表达水平;检测临床结直肠癌和癌旁组织中PGC-1α的蛋白表达水平。3.构建稳转PGC-1α的人结直肠癌细胞株:购买3个包含不同PGC-1α shRNA序列的PLKO.1载体质粒和1个PGC-1α过表达的PHBLV载体质粒。随机选取两个PGC-1α表达量中等的结直肠癌细胞系DLD-1和LoVo,利用慢病毒转染技术,同时构建稳定敲低和过表达PGC-1α的结直肠癌细胞株。利用蛋白质免疫印迹检测稳转细胞株中PGC-1α的敲低以及过表达效果,判断稳转细胞株是否建立成功。4.细胞增殖实验:检测PGC-1α敲低和过表达对人结直肠癌细胞增殖能力的影响。5.平板克隆实验:检测PGC-1α敲低和过表达对人结直肠癌细胞克隆形成能力的影响。6.Transwell迁移侵袭实验:检测PGC-1α敲低和过表达对人结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。检测PGC-1α敲低和过表达的人结直肠癌细胞条件培养基对HUVECs迁移和侵袭能力的影响。7.细胞免疫荧光:与蛋白质免疫印迹一起检测PGC-1α敲低和过表达对人结直肠癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志物表达的影响。8.细胞划痕实验:检测敲低和过表达PGC-1α的人结直肠癌细胞条件培养基对HUVECs迁移能力的影响。9.小管形成实验:检测敲低和过表达PGC-1α的人结直肠癌细胞条件培养基对HUVECs管腔形成数量的影响。10.裸鼠皮下成瘤模型:选用DLD-1对照组(PLKO.1)和敲低PGC-1α的DLD-1(sh1)稳转细胞株进行裸鼠皮下成瘤实验,观察敲低PGC-1α对结直肠癌体积、重量、增殖、侵袭、EMT及血管生成的影响。结果1.组织芯片结果显示PGC-1α在人结肠腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.001),且结肠腺癌组织中PGC-1α的表达水平与淋巴结转移呈正相关(P<0.05)。2.PGC-1α在7株人结直肠癌细胞中的表达水平均高于正常结肠上皮细胞。20对临床结直肠癌样本中,有13对结直肠癌样本中PGC-1α的表达水平明显高于癌旁组织;10对具有淋巴结转移的结直肠癌样本中有6对样本PGC-1α的表达水平高于癌旁组织。3.蛋白质免疫印迹结果显示敲低和过表达PGC-1α的结直肠癌稳转细胞株构建成功。4.PGC-1α敲低抑制人结直肠癌细胞DLD-1和LoVo的增殖能力;PGC-1α过表达增强人结直肠癌细胞DLD-1和LoVo的增殖能力。5.PGC-1α敲低抑制人结直肠癌细胞DLD-1和LoVo的克隆形成能力;PGC-1α过表达增强人结直肠癌细胞DLD-1和Lo Vo的克隆形成能力。6.PGC-1α敲低抑制人结直肠癌细胞DLD-1和LoVo的迁移、侵袭能力,其条件培养基抑制内皮细胞HUVECs的迁移、侵袭能力;PGC-1α过表达增强人结直肠癌细胞DLD-1和LoVo的迁移、侵袭能力,其条件培养基增强内皮细胞HUVECs的迁移、侵袭能力。7.PGC-1α敲低抑制人结直肠癌细胞中Ki67、MMP9、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平,促进E-cadherin的蛋白表达水平;过表达PGC-1α促进人结直肠癌细胞Ki67、MMP9、N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平,抑制E-cadherin的蛋白表达水平。8.细胞划痕实验结果显示PGC-1α敲低的人结直肠癌细胞条件培养基抑制HUVECs的迁移能力,PGC-1α过表达的人结直肠癌细胞条件培养基增强HUVECs的迁移能力。9.PGC-1α敲低的人结直肠癌细胞条件培养基抑制HUVECs的血管生成能力;PGC-1α过表达的人结直肠癌细胞条件培养基增强HUVECs的血管生成能力。10.裸鼠皮下成瘤模型:与对照组相比,敲低PGC-1α的DLD-1(sh1)组裸鼠的肿瘤重量明显减小,肿瘤体积生长速度显著减慢,差异均具有统计学意义(P<0.001)。敲低PGC-1α的DLD-1(sh1)组肿瘤微血管密度减少,CD31蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。敲低PGC-1α抑制体内结直肠癌细胞移植瘤中Ki67、MMP9、N-cadherin、Vimentin和CD31的蛋白表达水平,促进E-cadherin的蛋白表达水平。结论1.PGC-1α在人结直肠腺癌组织细胞中高表达,且与结肠腺癌淋巴结转移呈正相关。2.PGC-1α促进人结直肠癌细胞生长、迁移、侵袭及人脐静脉内皮细胞迁移、侵袭和血管生成。