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星形胶质细胞(astrocyte,AC)是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中分布最广,也是胶质细胞中体积最大的一类细胞,参与多种生理或病理过程。AC在生理状态下主要在能量代谢调节、谷氨酸(glutamic acid,Glu)的动态平衡、神经营养因子分泌、神经递质清除、突触可塑性以及血脑屏障完整性的维持等多个方面发挥重要作用。许多研究表明,AC的激活及其介导的炎症反应在神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、等的病理过程占有重要的地位。当机体受到损伤刺激时,小胶质细胞首先被激活,释放的炎症因子可激活AC,被活化后的AC进一步加剧炎症反应,最终促进神经元的损伤和退化。因此,如何有效抑制星型胶质细胞的炎症反应,减轻胶质细胞的过度活化成为治疗神经退行性疾病的潜在靶标。淫羊藿(Herba Epimedii)是一种传统中药材,属于小柴科淫羊藿属植物,其主要活性成分为淫羊藿总黄酮(Epimedium flavonoids),具有补肾、治疗骨质疏松症、改善机体的免疫功能以及延缓衰老、抑制肿瘤生长、对抗炎症反应等药理活性。淫羊藿素(icaritin,ICT)是淫羊藿总黄酮的活性成分淫羊藿苷(icariin,ICA)的水解产物,具有类雌激素样的甾体骨架结构。有文献报道,ICT可通过雌激素核受体(estrogen receptorα/β,ERα/β)依赖的信号途径对抗β淀粉样蛋白诱导的原代大鼠神经元的神经保护作用。本课题的前期研究工作证明了ICT可通过雌激素膜受体G蛋白耦联雌激素(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)和胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)信号途径抑制BV2小胶质细胞炎症反应,发挥其对DA能神经元的保护作用。但ICT是否能够通过GPER、ER及IGF-1R介导的信号途径,抑制原代星形胶质细胞的炎症反应,目前尚不清楚。本研究在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制备的大鼠原代培养的中脑星形胶质细胞炎症模型上,采用real time PCR和western blot技术方法,观察ICT的抗炎作用,并结合药理阻断,明确ICT抗炎作用是否与GPER、ER及IGF-1R有关。此外,为进一步明确ICT的作用机制,本研究应用ICT单独作用于星形胶质细胞,观察其对星形胶质细胞功能活动的影响及其可能的信号途径。实验结果如下:1.淫羊藿素对LPS诱导的原代星形胶质细胞炎症反应抑制作用的机制研究(1)LPS(1μg/m L)处理原代星形胶质细胞,能够明显增加肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)mRNA的表达(2)(p<0.001),不同浓度ICT(0.1、1、10和20μM)能够以剂量依赖性的方式抑制LPS诱导的炎症反应。其中10μM和20μM ICT作用最明显(p<0.001)。在后续实验当中,我们选用10μM进行机制探讨。(3)GPER特异性阻断剂G15(1μM)能够阻断ICT对LPS诱导的TNF-α、IL-1β、COX-2和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)mRNA表达的抑制作用(p<0.05,p<0.01)。(4)G15不能阻断ICT对LPS诱导的COX-2和i NOS蛋白表达的抑制作用(p>0.05)。(5)ERα/β特异性阻断剂ICI182,780不能阻断ICT在mRNA水平对TNF-α和IL-1β表达的抑制作用(p>0.05),但能够在mRNA水平对LPS诱导的COX-2和i NOS的表达具有一定的抑制作用(p<0.01,p<0.05)。(6)IGF-1R的特异性抑制剂JB-1(1μg/m L)能够明显抑制ICT对LPS诱导的TNF-α、IL-1β、COX-2和i NOS mRNA的表达作用(p<0.001)。(7)JB-1和ICI182,780均能够阻断ICT对LPS诱导的COX-2和i NOS蛋白表达的抑制作用(p<0.05)。2.淫羊藿素调节星形胶质细胞生理功能的机制研究(1)ICT单独作用原代星形胶质细胞1 h、2 h、4 h或6 h,能够时间依赖性的促进胶质细胞起源的神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)和c-fos mRNA的表达。其中GDNF在2 h上调最明显(p<0.001),而c-fos在1 h上调最明显(p<0.001)。(2)分别应用G15或JB-1预处理细胞,可以阻断ICT对c-fos和GDNF mRNA表达的促进作用(p<0.05,p<0.01)。(3)ICT单独作用星形胶质细胞不同时间(1、2、4、6 h),能够时间依赖性调节谷氨酸转运体1(glutamate transptor-1,GLT-1)、谷氨酸-天冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporter,GLAST)mRNA的表达(p<0.05,p<0.01)。(4)G15或JB1预处理可以阻断ICT对GLT-1和GLAST mRNA表达的调控(p<0.05,p<0.01)。(5)ICT单独作用星形胶质细胞5、10、20、30 min,可以时间依赖性增加c AMP反应元件结合蛋白(c AMP responsive element-binding protein,CREB)的磷酸化水平(p<0.01),此作用能够被G15阻断(p<0.05)。(6)ICT单独作用星形胶质细胞5、10、20、30 min,可以时间依赖性增加ERK和Akt磷酸化水平,其中30 min的作用最明显(p<0.01)。(7)ICT对ERK、Akt磷酸化水平的促进作用能够被JB-1阻断(p<0.05)。结论:ICT能够抑制LPS诱导的中脑原代星形胶质细胞的炎症反应,GPER、ERα/β和IGF-1R介导的信号途径参与了ICT的抗炎作用。ICT能够通过GPER和IGF-1R信号途径调控星形胶质细胞的生理功能。本研究为传统中药的开发提供了直接的实验依据。