论文部分内容阅读
背景卵巢上皮癌（EOC）是致死率第一位的妇科恶性肿瘤,目前治疗手段为在理想的肿瘤细胞减灭术的基础上辅助紫杉醇联合铂类的化疗。近年来,分子靶向和免疫靶向药物应用于临床,为卵巢癌的治疗带来了一线曙光[1,2],但仍有约80%的患者最终走向复发,晚期患者5年生存率仍徘徊在30%左右[3-5]。肿瘤细胞对于化疗药物的耐受性被认为是主要原因,其发生机制仍不清楚,从而成为卵巢癌治疗中的巨大障碍。肿瘤干细胞是一群不断自我更新、具有多向分化潜能、但处于相对静止状态的恶性细胞亚群。大量研究发现血液系统、多种实体肿瘤中存在着CSCs（cancerstem cells）,它们通过自我更新、分化维持着肿瘤细胞的致瘤性及细胞异质性,因其在肿瘤中保持着静息状态,从而逃避化疗药的胞内作用,导致肿瘤的耐药,并在肿瘤的侵袭转移中发挥着重要作用[6,7]。随着肿瘤干细胞的深入研究,目前已建立了一系列可靠的CSCs分离、鉴定方法,以便于对其作用机制进一步探索。对于卵巢癌干细胞,目前研究最多的标记物为CD133、CD24、CD117、CD44、ALDH1A1以及CD90等,它们发挥干性的机制主要包括肿瘤细胞本身及其微环境的改变、表观遗传学机制、信号通路的调控等方面,但对于哪个或者哪些蛋白可以标记卵巢癌干细胞并未达成共识,仍然存在争议[7-12]。因此,寻找卵巢癌特异性表面标记蛋白并探索其作用机制,对于卵巢癌的靶向治疗提供了重要线索。本课题组前期通过微量蛋白组学技术、比较蛋白组学分析,筛选出卵巢癌表面标记候选蛋白CDC50A,并在细胞系、原代组织细胞中成功分离纯化CDC50A+细胞,通过体外、体内实验充分证实了 CDC50A是卵巢癌干细胞表面标记蛋白,并通过细胞系体外耐药实验、小鼠模型体内耐药实验进一步说明CDC50A参与了卵巢癌耐药性的形成,同时利用RNA干扰技术再次佐证了 CDC50A具有卵巢癌干细胞标志物的特性,进一步利用RT-PCR技术筛选出的与CDC50A相关的P4型腺苷三磷酸酶磷脂转移蛋白家族（P4 family of ATPase phospholipid transporting,简称 P4-ATPases）。2004年Nature杂志宣告人类基因组图谱完成,这为人类基因的生物学功能及基因间相互作用研究提供了重要依据[13]。对基因的结构功能、转录翻译的研究都是以克隆目的基因为基础的,获取目的基因的全长序列,进行核酸序列的生物信息学分析是对其结构分析、功能预测的重要保障。目前常用的获取某基因全长序列的方法是RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术,设计引物从低丰度转录本中对已知cDNA片段5’和3’末端旁侧进行快速扩增[14]。本研究采用RACE技术获取目的基因的全长cDNA序列,为进一步深入研究目的基因功能及其与CDC50A关系奠定了基础。腺苷三磷酸酶磷脂转移蛋白家族（family of ATPase phospholipid transporting）分布广泛,它以三磷酸腺苷为能量的多级跨膜转运蛋白,参与转运多种物质,维持生命活动的重要功能蛋白[15]。其中P4-ATPases仅存在于真核生物中,人体中与CDC50A功能有关的P4-ATPases基因有11种,分别为ATP8A1、ATP8A2、ATP8B1、ATP8B2、ATP8B4、ATP10A、ATP10B、ATP10D、ATP11A、ATP11B、ATP11C[16,17]。本研究承接前期研究成果,对过表达CDC50A的SKOV3细胞进行干细胞特性的研究,进一步验证了 CDC50A具有卵巢癌干细胞特性;通过分子克隆技术得到载有目的基因的表达载体,慢病毒感染技术构建稳定表达目的基因的细胞,继而探究ATP11A、ATP11B对卵巢癌细胞干性的影响;通过共同上调CDC50A和ATP11A或ATP11B,研究ATP11A、ATP11B对CDC50A卵巢癌干细胞特性的影响,进一步对CDC50A干细胞特性的顺铂耐药机制进行了初步研究。方法1、CDC50A-flag-GFP质粒的鉴定及慢病毒表达载体的构建,感染SKOV3细胞,筛选鉴定过表达CDC50A的SKOV3细胞,并利用sphere形成实验及顺铂耐药实验对其干细胞特性进行探究。2、基于ATP11A、ATP11B全基因组序列及表达载体序列,进行克隆策略的设计,ATP11A基因组序列分段克隆,并在3’端引入myc标签蛋白,ATP11B基因组序列全长克隆,并在3’端引入HA标签蛋白。通过PCR产物回收纯化、TA克隆、转化TOP10感受态细胞、菌株扩增、质粒提取获得重构克隆载体,然后通过琼脂凝胶电泳、限制性核酸内切酶鉴定,最终测序后序列拼接及绘制系统树进行同源分析,完成准确无误的ATP11A、ATP11B全长基因组克隆。经过双酶切后,分别插入带有mcherry或RFP荧光筛选标记的表达载体pLVX-IRES上,再次酶切鉴定构建是否成功,测序验证保真性,获取ATP11A-myc-mcherry、ATP11B-HA-RFP表达质粒。表达质粒转染293FT细胞系,荧光显微镜定性观察转染情况,流式细胞学方法定量检测转染效率;利用Western blot方法检测标签蛋白以保证目的基因转录翻译顺利进行。ATP11A-myc-mcherry、ATP11B-HA-RFP慢病毒表达载体的构建,感染SKOV3细胞,筛选鉴定过表达ATP11A、ATP11B的SKOV3细胞,对其干细胞特性进行探究。3、构建双载体共感染SKOV3细胞,流式分选纯化:SKOV3共表达双基因组（SKOV3-CDC50A+ATP11A、SKOV3-CDC50A+ATP11B）,过表达单基因组（SKOV3-ATP11A+GFP、SKOV3-ATP11B+GFP、SKOV3-CDC50A+mcherry、SKOV3-CDC50A+RFP）以及阴性对照组（SKOV3-GFP+mcherry、SKOV3-GFP+RFP）。流式细胞技术定量测定共感染细胞的纯度。免疫荧光技术检测标签蛋白以保证目的基因的蛋白表达。采用无血清悬浮培养的方法检测不同组间sphere形成能力以及sphere对顺铂耐药性。利用5umol/l顺铂诱导卵巢癌细胞早期凋亡,流式细胞技术检测 SKOV3-CDC50A+ATP11A、SKOV3-CDC50A+ATP11B 组与 SKOV3-CDC50A间早期凋亡率的差异。结果1、SKOV3-CDC50Asphere 形成显著增多（25.5±4.76VS9.8±4.26,P=0.000）。浓度梯度顺铂处理sphere后,当CDDP浓度为5umol/l、10umol/l时,CDC50A组对顺铂均具有耐药性（P=0.040,P=0.011）。浓度5umol/l的CDDP作用时间曲线可见,过表达CDC50A可显著增强sphere的顺铂耐药性（P=0.039）。2、SKOV3-ATP11A 的 sphere 形成能力无显著性增强（10.7±2.828VS8.0±2.121,P=0.185）;SKOV3-ATP11B 的 sphere 形成能力也无显著性增强（7.0±2.121 VS6.7±1.414,P=0.795）。顺铂处理 sphere 后,对过表达 ATP11A、ATP11B sphere 的抑制作用一致,差异无统计学意义（P=0.248,P=0.093）。3、共表达CDC50A+ATP11A或CDC50A+ATP11B组与单独上调CDC50A组相比,sphere 形成显著增多（21.7±2.3VS12.3±3.2,P=0.015;18.7±4.2VS10.3±2.1,P=0.036）。浓度梯度顺铂处理sphere,当CDDP浓度为1umol/1时,过表达CDC50A组及对照组RSN=1,共表达双基因组RSN>1,说明低剂量顺铂可以诱导加强 CDC50A+ATP11A、CDC50A+ATP11Bsphere 形成,其 RSN 值较 CDC50A 组差异有统计学意义（P=0.004,P=0.029）;当CDDP浓度为5umol/l时,共表达双基因组RSN=1,说明该剂量顺铂对双基因组sphere的形成无抑制作用,CDC50A+ATP11A、CDC50A+ATP11B 组较 CDC50A 组差异有统计学意义（P=0.024,P=0.025）;CDDP 浓度为 10umol/l 时,各组细胞 RSN 均小于 1,但 CDC50A+ATP11A、CDC50A+ATP11B组较CDC50A组的RSN值差异无统计学意义。浓度5umol/l的CDDP作用时间曲线可见,共表达CDC50A+ATP11A、CDC50A+ATP11B组较过表达CDC50A组,可显著增强sphere的顺铂耐药性（P=0.024,P=0.024）。利用顺铂诱导细胞早期凋亡发现,单表达CDC50A组与空载体组相比,早期凋亡细胞的比例明显减少;当CDC50A与ATP11A或ATP11B共表达时,早期凋亡细胞比例较CDC50A组明显减少。结论1、卵巢癌细胞中CDC50A上调表达后可显著增强卵巢癌的干细胞特性。2、分子克隆技术是分析研究基因功能的重要手段,可以高效、特异性上调目的基因。单独上调ATP11A、ATP11B分子后,并不能增强卵巢癌干细胞特性。3、在卵巢癌细胞中,ATP11A、ATP11B均可协助增强CDC50A干细胞特性,并在一定的顺铂浓度下,通过抑制早期凋亡而增强其耐药性。