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蛋白质的类泛素修饰作为一种重要的翻译后修饰方式,参与细胞内广泛的生物学进程,对细胞内复杂而有序的生命活动进行调控。类泛素家族蛋白的氨基酸序列同源性较低,但其三维空间结构则却非常保守。类泛素蛋白修饰途径与泛素蛋白修饰途径类似,都是通过三步酶促反应将其自身共价连接到底物上,从而影响底物的功能。作为一类类泛素修饰蛋白,Ufm1(ubiquitin-fold modifier1)在除酵母以外的真核生物中十分保守,目前经研究证实的Ufm1及其修饰的主要功能是维持内质网内环境稳定,参与调节内质网压力应激。此外,在生理上,Ufm1系统还在胚胎发育、血细胞分化和肿瘤发生等进程中起着重要作用,但这些功能的具体机制仍有待探究。布氏锥虫是导致非洲锥虫病的病原体,也是研究单细胞真核生物生命活动的模式生物。布氏锥虫中Ufm1蛋白的结构及生物学功能仍不清楚。在本研究中,对布氏锥虫Ufm1蛋白的结构及其细胞功能开展了研究,以此为揭示Ufm1系统的功能提供一些新的方向。
通过序列比对,找到了布氏锥虫中类泛素蛋白Ufm1的同源蛋白TbUfm1。通过对原位表达TbUfm1蛋白的细胞系的亲和纯化及质谱分析,共鉴定到约100种TbUfm1底物蛋白及相关蛋白。这些蛋白中,发现了布氏锥虫中Ufm1的E1酶、E2酶及E3酶的同源蛋白TbUba5、TbUfc1和TbUfl1。另外,通过序列分析也找到了Ufm1特异性剪切酶2的同源蛋白TbUfsp2。利用体外酶促修饰反应,证明了这四个蛋白分别是布氏锥虫TbUfm1修饰系统的E1、E2、E3和特异性剪切酶,且TbUba5第271位与TbUfc1第115位的半胱氨酸是催化活性中心,对体外酶促修饰反应的顺利进行必不可少。
同时,解析了TbUfm1的核磁溶液结构。TbUfm1由三个α螺旋和四个β片层组成,其中心螺旋α1与四个β片层构成了类泛素蛋白的典型折叠。与人的Ufm1结构相比,TbUfm1有着更长的N端延伸,更短的β3片层和一个额外的超短螺旋α2。进行了TbUba5、TbUfc1和TbUfl1分别滴定TbUfm1的核磁化学位移微扰实验,发现TbUfm1能通过其α1α2β1β2构成的疏水界面在体外与TbUba5结合,人的Ufm1与Uba5结合界面与此类似,两者之间存在许多保守的结合位点。
进一步地,对布氏锥虫TbUfm1蛋白及其修饰系统的细胞功能进行了探究。在TbUfm1底物蛋白及相关蛋白中,细胞骨架蛋白占四分之一,通过细胞骨架抽提,发现TbUfm1、TbUba5、TbUfc1和TbUfl1在细胞骨架上均有分布,说明TbUfm1及其修饰系统可能参与了骨架相关的细胞活动。在TbUfm1底物蛋白及相关蛋白中,还存在一个保守底物TbUfbp1(Ufbp1的同源物)和一个锥虫属特有底物TbCAP80。TbUfbp1能在体外被TbUfm1修饰,其人的同源蛋白Ufbp1对维持内质网稳态起着重要作用,这暗示TbUfm1及其修饰可能也具有类似的功能。TbCAP80是一个多功能蛋白,为细胞生长所必需,敲除TbUfm1和TbCAP80均减弱了细胞对葡聚糖的内吞作用,证明了TbUfm1在囊泡运输方面的功能。除此之外,还发现TbUfm1与TbCAP80均定位于布氏锥虫糖酵解酶体上,这暗示了TbUfm1与细胞糖酵解相关。为了证明这个推断,检测了TbUfm1的敲除前后的细胞能量代谢物,发现TbUfm1的敲除会导致NADH和延胡索酸盐产量下降。另外,饥饿刺激会使TbUfm1修饰水平迅速上调,其中TbUfm1修饰的E2酶含量上升明显。这些结果说明TbUfm1参与到布氏锥虫能量代谢与饥饿应激的细胞活动中。在人的293细胞中,Ufm1在饥饿条件下能发生细胞定位的变化,与糖酵解酶体的标志物果糖-二磷酸醛缩酶共定位,暗示TbUfm1参与细胞饥饿应激这一功能可能在布氏锥虫和人细胞中是保守的。总之,不仅证明了布氏锥虫TbUfm1蛋白及其修饰在维持内质网稳定,调控囊泡运输方面的保守功能,并且揭示了其在糖酵解、能量代谢以及细胞饥饿应激方面的新功能。
通过序列比对,找到了布氏锥虫中类泛素蛋白Ufm1的同源蛋白TbUfm1。通过对原位表达TbUfm1蛋白的细胞系的亲和纯化及质谱分析,共鉴定到约100种TbUfm1底物蛋白及相关蛋白。这些蛋白中,发现了布氏锥虫中Ufm1的E1酶、E2酶及E3酶的同源蛋白TbUba5、TbUfc1和TbUfl1。另外,通过序列分析也找到了Ufm1特异性剪切酶2的同源蛋白TbUfsp2。利用体外酶促修饰反应,证明了这四个蛋白分别是布氏锥虫TbUfm1修饰系统的E1、E2、E3和特异性剪切酶,且TbUba5第271位与TbUfc1第115位的半胱氨酸是催化活性中心,对体外酶促修饰反应的顺利进行必不可少。
同时,解析了TbUfm1的核磁溶液结构。TbUfm1由三个α螺旋和四个β片层组成,其中心螺旋α1与四个β片层构成了类泛素蛋白的典型折叠。与人的Ufm1结构相比,TbUfm1有着更长的N端延伸,更短的β3片层和一个额外的超短螺旋α2。进行了TbUba5、TbUfc1和TbUfl1分别滴定TbUfm1的核磁化学位移微扰实验,发现TbUfm1能通过其α1α2β1β2构成的疏水界面在体外与TbUba5结合,人的Ufm1与Uba5结合界面与此类似,两者之间存在许多保守的结合位点。
进一步地,对布氏锥虫TbUfm1蛋白及其修饰系统的细胞功能进行了探究。在TbUfm1底物蛋白及相关蛋白中,细胞骨架蛋白占四分之一,通过细胞骨架抽提,发现TbUfm1、TbUba5、TbUfc1和TbUfl1在细胞骨架上均有分布,说明TbUfm1及其修饰系统可能参与了骨架相关的细胞活动。在TbUfm1底物蛋白及相关蛋白中,还存在一个保守底物TbUfbp1(Ufbp1的同源物)和一个锥虫属特有底物TbCAP80。TbUfbp1能在体外被TbUfm1修饰,其人的同源蛋白Ufbp1对维持内质网稳态起着重要作用,这暗示TbUfm1及其修饰可能也具有类似的功能。TbCAP80是一个多功能蛋白,为细胞生长所必需,敲除TbUfm1和TbCAP80均减弱了细胞对葡聚糖的内吞作用,证明了TbUfm1在囊泡运输方面的功能。除此之外,还发现TbUfm1与TbCAP80均定位于布氏锥虫糖酵解酶体上,这暗示了TbUfm1与细胞糖酵解相关。为了证明这个推断,检测了TbUfm1的敲除前后的细胞能量代谢物,发现TbUfm1的敲除会导致NADH和延胡索酸盐产量下降。另外,饥饿刺激会使TbUfm1修饰水平迅速上调,其中TbUfm1修饰的E2酶含量上升明显。这些结果说明TbUfm1参与到布氏锥虫能量代谢与饥饿应激的细胞活动中。在人的293细胞中,Ufm1在饥饿条件下能发生细胞定位的变化,与糖酵解酶体的标志物果糖-二磷酸醛缩酶共定位,暗示TbUfm1参与细胞饥饿应激这一功能可能在布氏锥虫和人细胞中是保守的。总之,不仅证明了布氏锥虫TbUfm1蛋白及其修饰在维持内质网稳定,调控囊泡运输方面的保守功能,并且揭示了其在糖酵解、能量代谢以及细胞饥饿应激方面的新功能。