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实验目的:通过对小鼠BMSCs施加一定的拉伸应力刺激,研究力学因素对小鼠BMSCs成骨分化过程的影响,进一步探讨成骨分化过程中细胞的生物力学-生物化学偶联机制。实验方法:无菌条件下提取昆明小鼠BMSCs,体外传代培养至第3代后,进行细胞表型的鉴定。将细胞接种于底部具有弹性膜的拉伸六孔板上。根据细胞不同的培养条件,实验共分为3组。实验组(A组):成骨诱导培养基培养+拉伸刺激;单纯诱导组(B组):成骨诱导培养基培养;空白对照组(C组):普通培养基培养。采用Flex-cell5000细胞力学加载系统给予实验组6%形变幅度的正弦波刺激,频率0.5Hz,4h/d。各组细胞均2天换液1次,共培养1周。实验结束后RT-PCR法检测各组细胞BMP-2、Runx2和ALP m RNA的表达情况,ELISA法检测培养基中Col1的含量,并对各组细胞进行茜素红染色观察钙结节形成情况。实验结果:1.提取的原代细胞呈圆形或类圆形,所含杂质较多,24h后首次换液,去除漂浮死细胞,显微镜下观察可见有部分细胞贴壁,呈短梭形或多角形。继续培养48h后以1:2进行细胞传代,显微镜下观察传代后细胞生长加速,呈长梭形、漩涡状生长。流式细胞仪细胞表型鉴定结果:96.4%的细胞表达CD29,97.2%的细胞表达CD90,1.7%的细胞表达CD34,1.3%的细胞表达CD45。2.RT-PCR检测:细胞培养1周后,与C组相比,A、B两组BMP-2、Runx2、ALP的mRNA表达量均明显升高,差异具有统计学差异(P<0.05)。与B组相比,A组BMP-2、Runx2、ALP mRNA表达量增高,差异有统计学差异(P<0.05)。3.ELISA检测Col1的含量:A、B两组各时间段培养基中Col1的含量均高于C组,且随着诱导时间的延长逐渐增加。A组培养基中Col1终浓度高于B组,诱导效果最明显。4.茜素红染色:倒置显微镜下观察A、B两组均出现明显深染钙结节,证明两组诱导成骨分化均显著,且A组视野中钙结节多于B组,C组并无出现深染钙结节。实验结论:拉伸应力刺激在小鼠BMSCs向成骨细胞分化的过程中具有重要作用。其可能通过促进BMSCs成骨因子BMP-2的分泌,从而调控下游靶基因Runx2的表达,进而促进BMSCs向成骨细胞分化。