木质素是植物体内含量仅次于纤维素的生物大分子,属于高分子聚合的芳香醇类物质,主要存在于木纤维及管状分子中。研究发现,在植物细胞分化、果实发育及抗病过程中,木质素均有重要的生理功能。此外,木质素也广泛应用于造纸、铸造、冶炼、化工、橡胶、环境保护等领域,具有非常重要的经济价值。因此,通过解析木质素生物合成机制,将有利于更好地利用资源植物,在生产上具有重大的科学意义和产业前景。人们对植物体内生物素合成的途径已经具备了一定的认识。在木质素合成途径中,一系列具有特异催化活性的酶主导了木质素的合成。这些直接参与木质素合成途径的因子,其自身的表达则受到外部环境和内在遗传因素的双重控制。其中,MYB家族的转录因子具有重要的作用,被认为直接或间接的控制了植物的木质部发育和木质素含量。杨树(Populus trichocarpa)是世界范围内种植最广的速生树木,是重要的建筑用材和造纸原料,同时还可作为生物质能源的原料。随着基因组测序的完成,杨树己作为木本模式植物广泛应用于木质素合成的研究。然而,对于杨树中木质素合成的调控机制,目前还了解的不多。因此,研究杨树中MYB家族转录因子对木质素合成途径进行调节的特点和具体机制,有助于提高我们对杨树木质素含量和组分决定机制的认识,帮助我们通过基因工程学方法改造杨树品种,得到木质素含量和组分有利于生产需求的转基因品系,有着非常重要的理论价值和现实意义。在前期生物信息学分析的基础上,我们筛选到两个可能参与木质素合成的MYB转录因子：PtrMYB092和PtrMYB152。为了阐明它们在杨树木质素合成中的功能和机制,分别进行了下述研究：1、克隆杨树PtrMYB092和PtrMYB152基因并构建植物表达载体。从杨树基因组中克隆获得了PtrMYB092和PtrMYB152基因,并测序它们的全长序列。将这两个基因的编码序列、启动子序列分别构建在植物表达载体中,获得用于转基因超表达、启动子分析、亚细胞定位分析和酵母单杂交实验的载体,并分别转化植株材料和酵母菌株,获得了转基因阳性株系。2.PtrMYB092和PtrMYB152在植物木质化部位特异表达。野生型杨树中,PtrMYB092和PtrMYB152在木质部、根、茎、叶柄均有较高的表达量,虽然不是木质部特异性表达,但仍是富含木质素的部位。拟南芥中的启动子分析显示,较强的GUS活性出现在了茎、叶柄和叶脉中,柱头、萼片、根也可观察到蓝色。组织表达和启动子分析说明,PtrMYB092和PtrMYB152表达位置跟木质素合成的位置重叠。3.PtrMYB092和PtrMYB152是转录激活因子。亚细胞定位的结果显示,作为转录因子,PtrMYB092和PtrMYB152蛋白定位在细胞核内。通过酵母单杂交的实验,证明它们起转录激活的作用,为激活型的转录因子。4、PtrMYBB092和PtrMYB152激活了木质素合成途径中关键酶的表达。通过荧光定量PCR检测,发现在PtrMYB092和PtrMYBl52超表达的转基因杨树中,部分木质素合成相关的酶和转录因子的编码基因的表达量有不同程度变化。其中,多个木质素合成途径中关键酶的表达被PtrMYB092和PtrMYB152上调了。5、PtrMYB092和PtrMYB152促进了木质素的合成和异位沉积。通过一系列组织化学染色和生化分析检测,发现在PtrMYB092和PtrMYB152超表达的转基因杨树中,木质素在次生韧皮部发生了异位沉积,含量显著提高。与之对应的是,木质部导管细胞的管壁相比野生型明显加厚、管内空腔相应变小。通过上述的植物遗传和分子实验,我们证明PtrMYB092和PtrMYB152参与了植物中木质素合成的调控,说明了它们在木质素合成中发挥着重要作用,并阐明了它们的作用机制：通过激活下游转录因子和关键酶基因的表达,提高木质素的合成速率,促进植物细胞次生壁的木质化。这些结果为今后进一步研究植物体内木质素合成的控制机理,和为相关林业资源开发利用奠定了基础。