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藻胆蛋白是偶联藻胆色素的色素蛋白,在生物体内充当光受体。藻胆蛋白光受体可分为两类：天线藻胆蛋白、光敏藻胆蛋白。天线藻胆蛋白捕获光能并传递能量给光合作用系统,而光敏藻胆蛋白将光信号转化为生物化学信号,称为光敏色素蛋白。蓝细菌藻胆蛋白的天线复合物显示出高荧光特性,但也有明显的缺陷,在使其用做于良好的荧光标记物时,需要特定的色素合成酶以及藻胆蛋白裂合酶参与。近年,蓝细菌光敏色素的研究已有一些进展。保守的GAF结构域能自催化结合多种色素,包括BV、PCB、PVB甚至PEB、PUB。这一优良特性比藻胆蛋白用作可基因编码的荧光探针具有更多优点,大大增强了当前色素蛋白用作荧光探针的应用潜力。本实验室重组合成了一些在蓝藻体内并不存在的色素蛋白。这些色素蛋白虽然在天然蓝藻体内并不存在,但却可在体外利用不同色素与脱辅基蛋白组合生成,这在应用开发上具有很大潜力。利用这种重组方式,可定向选择合成人们需要的产物,如：荧光量子产率更高或者光谱范围更广的色素荧光蛋白,将他们用作优良的荧光标记材料。本论文尝试了来自三个藻种Nostoc sp. PCC7120、Synechocystis sp. PCC6803以及Thermosynechococcus elongatus BP-1中的16个GAF,分别与PEB色素合成酶基因在大肠杆菌体内共表达,产生色素蛋白PEB-GAF或PUB-GAF。其中9个可在大肠杆菌体内自催化色素化结合上PEB,并产生如荧光蛋白GFP一样的高荧光。将GAFs用PEB色素化,得到四个十分有趣的荧光蛋白：PEB-A11699GAF1、PUB(PEB)-A113691GAF2、 PEB(PUB)-All1280GAF2。 PEB-All21699GAF1最大荧光峰在586nm,发射橙红色荧光。PUB(PEB)-All3691GAF2最大荧光峰在498nm,发射绿色荧光。PEB(PUB)-A111280GAF2与PEB(PUB)-Slr1393GAf3相同,荧光在575nm处,有60-80nm的斯托克斯位移,发射橙色荧光。结合色素PEB且发生色素异构化的GAFs,可用作绿色、橙色、红色荧光标记物。用PEB色素化的GAFs,有以下优势：(1)GAF是一个偶联色素的小单位,其不需要裂合酶的催化。(2)PEB色素化后的GAFs有大的摩尔消光系数和高的荧光量子产率及亮度。(3)某些GAFs含有DXCF基序可将PEB异构为PUB,增加了PEB(PUB)一GAFs光谱的多样性。将荧光蛋白转化进大肠杆菌体内诱导表达,通过荧光显微镜的观察,可见明亮的荧光细胞。尽管GAF可自催化结合色素,但仍需要与色素合成酶基因共表达,而GFP作为荧光蛋白,不需要其他的辅助因子。因此,为了简化光敏色素合成途径,本论文用首尾相连逐步融合基因的方法解决这个问题。本论文将ho1和pebS先融合成一个基因编码框hol.pebS,然后再将gaf插入融合基因hol.pebS的5’末端。构建的融合基因gaf:hol:pebS连入表达载体后可在宿主细胞中直接诱导表达。本论文将实验室已有的来自于Nostoc sp. PCC7120的all2699的GAF结构域编码基因gafl、all1280的gaf2以及来自Synechocystis sp. PCC6803中的基因slr1393的gaf3分别与PEB色素合成酶基因hol:pebS融合,转化进大肠杆菌体内诱导表达,产生了色素蛋白PEB-GAF::HO1::PebS或PUB-GAF::HO1::PebS。光谱分析表明,光谱特征与简化前基本一致。这些经过分子设计的光敏色素复合物成为极有潜力的活细胞荧光生物标记物。色素化的GAFs可以进一步通过GCN4亮氨酸拉链结构域实现其寡聚化,以增强它们的摩尔消光系数和荧光量子产率。PEB可部分地向PUB转化,使寡聚的GAF"束”形成类似蓝藻中的捕光天线复合物中有趣的能量转移模型。良好的热、光化学稳定性及其强烈的荧光亮度,可成为极有潜力的荧光免疫检测标记物。这些结果通过光谱分析、荧光显微镜技术得以证实。色素荧光蛋白优异的光谱性质是GFP家族荧光蛋白的很好补充,尤其是它具有的橙红色荧光将为组织深度成像,超分辨显微技术,甚至三维数据存储技术提供便利。为对经分子设计的色素荧光蛋白进行进一步的分子优化,本论文在基因片段修剪克隆的基础上,成功实现重组PEB-GAF复合物的高效表达,实验鉴定其保持有正确的光谱活性,运用PDB数据库中已解析的GAF同源结构域成功解析了PEB-All2699GAF1复合物的晶体结构分辨率达1.7A的晶体。在分析结构的基础上进行了系列定点突变究,设计、构建、表达了3个相关突变体,结合相关生理实验分析,试图鉴定其活性部位及实现GAF结构域的单体化。本项研究通过将分子设计与结构生物学有机结合,不仅具有重要的基础理论意义,而且具有重要的应用前景。