论文部分内容阅读
短体线虫(Pratylenchus spp.)又称根腐线虫,是迁移性内寄生线虫,其寄主范围广泛,与孢囊线虫(Heterodera spp.)、根结线虫(Meloidogyne spp.)并称为三大植物病原线虫。我国南方的甘蔗和玉米等作物常受到玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、拟玉米短体线虫(P.parazeae)和最短尾短体线虫(P.brachyurus)的侵染,造成严重的经济损失。此外,玉米短体线虫和拟玉米短体线虫常常复合侵染,依靠传统形态学较难区分。因此,本研究建立了快速检测这三种短体线虫的多重PCR、实时荧光定量PCR及环介导等温扩增(LAMP)体系,取得了以下结果:1.构建了能同时检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的多重PCR体系。该体系包含4对引物,分别是可扩增所有线虫的通用引物D3A/D3B,特异扩增玉米短体线虫的引物18S/Praty-R,特异扩增拟玉米短体线虫的引物PpzF/PpzR以及特异扩增最短尾短体线虫的引物PbF2/PbR1。该体系特异性高,灵敏性也较高,能够同时检测三种单条短体线虫的混合DNA样品。2.基于rDNA-ITS区分别设计了玉米短体线虫实时荧光定量PCR特异性引物(qYF2/q YR2)和探针(qYP)以及拟玉米短体线虫特异性引物(qNF/qNR)和探针(qNP);同时基于mtDN A COI区设计了最短尾短体线虫特异性引物(q BF2/q BR1)和探针(qBP)。利用这些引物和探针建立了可分别检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的实时荧光定量PCR体系。该体系特异性高,扩增玉米短体线虫的Ct值是25.70-29.90;扩增拟玉米短体线虫的Ct值是25.35-25.67;扩增最短尾短体线虫的Ct值是22.19-22.81;灵敏性也高,可检测0.01条线虫DNA模板。3.基于mt DNA COI区分别设计了扩增三种短体线虫的环介导等温扩增引物组:包括特异扩增玉米短体线虫外的引物对PZF3/PZB3和内引物对PZFIP/PZBIP;扩增拟玉米短体线虫的外引物对PPF3/PPB3和内引物对PPFIP/PPBIP和扩增最短尾短体线虫的外引物对PBF3/PBB3和内引物对PBFIP/PBBIP。利用这些引物建立了能分别检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的环介导等温扩增体系。该体系特异性高,灵敏性高,可检测0.1条线虫DNA模板。4.应用三种分子检测体系对采自广东、湖南、福建、江西、广西和云南六省的76份土壤样品进行检测,其中实时荧光定量PCR体系检测成功率为100%;用环介导等温扩增体系检测时,能够检测到所有的靶标线虫,但有5个样品出现假阳性;用多重PCR体系在检测43个含有靶标线虫的样品,有6个样未检出玉米短体线虫,4个样未检出拟玉米短体线虫和1个样未检出最短尾短体线虫,但未出现假阳性。本研究建立的用于三种短体线虫快速分子检测体系可以快速检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫,其中实时荧光定量PCR体系对实际土壤线虫的混合DNA样品检测效果最高,成功率达到100%。本研究建立的快速分子检测体系为口岸检验检疫部门及农业部门快速检测短体线虫提供了有效手段,对由这三种短体线虫引起的根腐病的快速诊断具有较重要的意义。