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第一部分RIP1在AGEs诱导的SW1353细胞表达情况以及Nec-1对AGEs诱导SW1353细胞II型胶原和蛋白聚糖表达的影响。目的:1.研究不同浓度Nec-1对SW1353细胞24h增殖活力的影响,为实验选择合适药物浓度。2.研究RIP1在AGEs诱导的SW1353细胞表达情况,并进一步研究Nec-1对AGEs诱导SW1353细胞II型胶原和蛋白聚糖表达的影响,为研究RIP1在AGEs相关的细胞外基质降解中的作用提供实验依据。方法:1.依据文献选择0、50、100、150μM四个Nec-1浓度培养SW1353 24h,然后用CCK8检测其增殖活力。2.以SW1353细胞为研究对象,把它分为四组:(1).空白对照组;(2).50μg/mLAGEs组;(3).100 μg/mL AGEs组;(4).200μg/mL AGEs组。分别用上述不同浓度AGEs对SW1353诱导培养24h,分别采用Western blot检测RIP1表达水平和采用RT-PCR检测RIP1的mRNA表达水平。3.以SW1353细胞为研究对象,设置如下分组:(1).空白对照组;(2).100 μg/mL AGEs 阳性对照组;(3).50 μM Nec-1 预处理、100 μg/mL AGEs 诱导组;(4).100μM Nec-1预处理、100 μg/mL AGEs诱导组。Nec-1预处理2h后再和AGEs共培育24h后收集并提取样品蛋白,采用Western blot检测II型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达水平。结果:1.50、100μM Nec-1对SW13 5 3的24h增殖活力没有明显影响(P>0.05),而150μM Nec-1对SW1353的24h增殖活力有明显抑制作用(P<0.05),故选用50、100μM作为Nec-1以后的实验浓度。2.50μg/mL、100μg/mL、200μg/mLAGEs 均能明显诱导 SW1353 细胞 RIP1 的表达(P<0.05),并且随着AGEs浓度的增加,诱导SW1353细胞RIP1的表达呈浓度依赖性上升(P<0.05)。3.100μg/mLAGEs能明显增加SW1353的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的降解(P<0.05),而Nec-1能减少AGEs诱导的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的降解(P<0.05),并随浓度的增加抑制降解作用在加强(P<0.05)。结论:实验选用50、100μM Nec-1是安全可行的;AGEs促进软骨细胞外基质降解:RIP1参与了 AGEs诱导的软骨细胞外基质的降解;Nec-1能缓解AGEs诱导的软骨细胞外基质的降解。第二部分 Nec-1对AGEs诱导的SW1353的细胞外基质(Ⅱ型胶原和蛋白聚糖)降解酶及其抑制酶的影响目的:研究Nec-1对AGEs诱导的SW1353的细胞外基质主要成分降解酶及其抑制剂生成的影响,进一步完善Nec-1拮抗OA的分子生物学理论。方法:以SW1353细胞为研究对象,设置如下分组:(1).空白对照组;(2).100 μg/mLAGEs阳性对照组;(3).50 μM Nec-1 预处理、100 μg/mL AGEs 诱导组;(4).100μM Nec-1预处理、100 μg/mLAGEs诱导组。Nec-1预处理2H后再和AGEs共培育24h后收集样品提取细胞蛋白,采用 Western blot 检测 MMP-3、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达水平。提取RNA后采用RT-PCR检测MMP-3、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、ADAMTS-4 和 ADAMTS-5 的 mRNA 表达水平。结果:1.AGEs能明显促进SW1353细胞的MMP-3和MMP-13以及ADAMTS-4和ADAMTS-5的表达(P<0.05),并同时明显抑制了 MMPs的抑制剂TIMP-1、TIMP-2表达(P<0.05)。2.Nec-1预处理的情况下AGEs诱导的SW1353细胞MMP-3和MMP-13以及ADAMTS-4 和 ADAMTS-5 的表达明显下降(P<0.05),而 TIMP-1、TIMP-2 表达却明显增加(P<0.05),同时浓度变大,效果变强(P<0.05)。结论:AGEs通过促进细胞外基质降解酶类表达并抑制其抑制酶的表达而引起细胞外基质的降解;Nec-1是通过抑制AGEs对SW1353细胞外基质降解酶诱导和抑制酶抑制作用而减少细胞外基质的降解。第三部分 Nec-1调控AGEs诱导SW1353细胞外基质降解作用机制研究目的:明确Nec-1调控软骨细胞外基质降解的作用机制。方法:1.以SW1353细胞为研究对象,设置如下分组:(1).空白对照组;(2).100 μg/mL AGEs 阳性对照组;(3).50 μM Nec-1 预处理、100 μg/mL AGEs 诱导组;(4).100 μM Nec-1预处理、100 μg/mL AGEs诱导组。Nec-1预处理2h后再和AGEs共培育24h后收集样品提取细胞蛋白,采用Western blot检测细胞总JNK和磷酸化JNK及c-Jun和c-Fos表达。提取细胞核蛋白,采用Western blot检测p65的表达。2.分别将含有NF-κB启动子和含有(c-Jun/c-Fos)AP-1质粒转染SW1353细胞,转染6h后按如下分组干预培养:(1).空白对照组;(2).100μg/mL AGEs 阳性对照组;(3).50 μM Nec-1 预处理、100 μg/mL AGEs 诱导组;(4).100 μM Nec-1 预处理、100μg/mL AGEs诱导组。Nec-1预处理2h后再和AGEs共培育后荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性。结果:1.AGEs对JNK总量无明显影响(P>0.05)但能明显促进SW1353细胞的p-JNK的表达(P<0.05),而Nec-1能浓度依赖性抑制AGEs诱导的JNK磷酸化(P<0.05);2.AGEs能明显促进SW1353细胞的c-Jun和c-Fos的表达(P<0.05),而Nec-1能浓度依赖性抑制AGEs诱导的c-Jun和c-Fos的表达(P<0.05);3.AGEs能明显促进SW1353细胞核p65的表达(P<0.05),而Nec-1能浓度依赖性抑制AGEs诱导的p65的表达(P<0.05);4.AGEs能明显提高SW1353细胞c-Jun、c-Fos荧光素酶活性和NF-κB启动子的荧光素酶活性(P<05),而Nec-1能浓度依赖性抑制AGEs诱导的这些目标基因荧光素酶活性(P<0.05)。结论:Nec-1是通过JNK/AP-1信号通路和NF-κB信号通路起到抑制细胞外基质降解的作用。