论文部分内容阅读
背景及目的： 癫痫是常见的神经系统慢性疾患，在我国的发病率高达4-9‰，频繁持久的发作可导致患者脑功能不可逆性损伤，给患者家庭及社会带来严重负担。但是关于癫痫的发病原因目前仍不十分清楚。许多文献研究报道中枢神经系统炎症,尤其是免疫炎症在癫痫的发病机制中起到非常重要的作用，不仅可以诱发癫痫的发生还导致神经元损伤。脑外伤及脑缺血缺氧性疾病均可以诱发癫痫，进一步研究发现其都伴有免疫炎症反应这一过程，而免疫炎症反应可以提高神经元兴奋性。文献报道针对中枢神经系统的抗炎治疗，可以缓解部分癫痫患者的临床症状，而临床观察也发现抗炎治疗能够对癫痫起到一定的作用。 高迁移率蛋白1(High-mobility group box1,HMGB1)是一种具有多种生物学功能的高度保守的非组DNA结合蛋白，研究发现当受到刺激时主要有免疫细胞及坏死细胞释放出细胞外，通过与其TLR（toll-like receptor）受体结合激活细胞内核因子-kB(NF-KB)及其它细胞信号通路，进而发挥促炎症作用。TLR在脑部主要存在于神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞表面，与神经系统的多种病理损伤过程有关。文献报道脑缺血、脑炎等许多中枢神经疾病的病理过程都与HMGB1有关。因此进一步研究HMGB1中和抗体（HMGB1抑制剂）对脑部炎症反应及神经元的影响，对临床癫痫的预防及治疗具有重要意义。 材料与方法： 1.建立大鼠SE模型 取出生后21d(postnatal day21,P21)的纯种大鼠,经腹腔注射10％水合氯醛溶液(400mg/kg)麻醉，然后用立体定向仪进行定位，向侧脑室中用微量注射器缓慢注入2 nmol海人酸(kainic acid, KA)溶液。将全身持续发作或多次连续发作之间不能完全恢复正常状态超过半个小时者，定义为癫痫持续状态(status epilepticus, SE)。在SE开始后2 h给予10%水合氯醛溶液腹腔注射终止发作。不符和上述纳入标准的大鼠模型剔除。 2.分组以及药物干预 将 SE大鼠随机分成对照组（PBS）、模型组（KA+IgY组）、HMGB1中和抗体干预组，HMGB1中和抗体干预组又分为低剂量组，中剂量组以及高剂量（KA+anti-HMGBl组)。HMGB1中和抗体干预低、中、高剂量组分别给予1μg、2μg及4μg的量。而模型组利用侧脑室注射给予对照IgY(4μg)。在SE终止即刻后使用药物，同样时间点设置PBS对照组，给予侧脑室注射IgY(4μg)。 3.Real-time PCR 在SE后6 h，提取海马组织中的RNA，海马炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-a,TNF-α)mRNA以及白介素lβ(interleukin-lβ,IL-lβ)mRNA在海马组织中的表达利用Real-time-PCR方法进行检测。 4.免疫组织化学 在 SE后3 d，制作大鼠海马组织石蜡切片，海马组织胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Ibal以及ED1的表达变化利用免疫组化进行检测。 5.尼氏染色和FJB染色 SE后3 d，海马组织神经元的受损状况以及形态利用尼氏染色以及FJB染色途径进行检测。 结果： 1.HMGB1中和抗体对SE海马组织炎症因子的影响 RT-PCR实验结果示：SE后6 h，与PBS组相比较，KA+IgY组大鼠海马组织中 IL-lβ和 TNF-α mRNA表达明显增强(P<0.01)。而侧脑室注射2μg、4μgHMGBl中和抗体组可以明显观察到海马组织IL-1β和TNF-αmRNA表达受到抑制(P<0.05)，1μgHMGBl中和抗体组，则未明显观察到两炎性因子受到抑制(P>0.05)。 2. SE大鼠海马组织胶质细胞中HMGB1中和抗体的作用 SE后3 d，免疫组化结果表明，与对照组相比，侧脑室注射低剂量中和抗体（1μg）对海马GFAP、Ibal以及EDI免疫染色强度无明显作用（P>0.05)，中剂量与高剂量中和抗体（2μg和4μg）则对其有显著的抑制作用（P<0.01)。而KA+IgY组大鼠海马星形胶质细胞（GFAP）与小胶质细胞（Ibal和 EDI）免疫染色有显著的加强（P<0.01）。 3.SE大鼠海马组织神经元损伤中HMGB1中和抗体的作用 SE后3 d，FJB染色与尼氏染色结果表明，在PBS组中海马神经元无损伤且形态结构无异常。KA+IgY组大鼠海马出现明显的神经元损伤现象，其中FJB染色阳性神经元有明显增加（P<0.01)，而尼氏染色阳性神经元有显著的下降，且与CA1区相比，Hilus区与CA3区中神经元损伤更明显。而侧脑室注射低剂量中和抗体（1μg）无明显作用（P>0.05)，中剂量以及高剂量中和抗体（2μg和4μg）则神经元损伤有明显减轻（P<0.05)。 结论： HMGB1中和抗体注入侧脑室对抑制胶质细胞活化和海马炎症因子合成具有一定的剂量依赖性，同时具有降低神经元损伤及神经保护作用。