论文部分内容阅读
目的:验证补青颗粒对db/db糖尿病小鼠早中期糖尿病性白内障所导致的晶状体损伤的保护作用,探讨补青颗粒通过调控“线粒体自噬”中受损线粒体的启动阶段的相关信号转导通路（Pink1-Parkin信号通路、Bnip3/Nix信号通路、FUNDC1信号通路）,以延缓糖尿病性白内障所致的晶状体损伤的分子机制,为早中期糖尿病性白内障的发病机制及治疗靶向提供新思路。方法:选用db/db小鼠（6周龄）,再分别给予补青颗粒及阳性对照药杞菊地黄丸干预后,观察小鼠的一般状况以及血糖,血脂水平;HE染色法观察晶状体病理变化;采用免疫组化法检测db/db小鼠晶状体组织中PINK1和LC3蛋白的表达。采用蛋白质印迹法（Western Blot;WB）技术,和实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System;QPCR）技术,检测Bnip3、Nix、FUNDC1在小鼠晶状体组织中的表达。采用永生化人晶状体上皮细胞（SRA01/04）并用H2O2诱导制备模型。将SRA01/04细胞分成6组,予以补青颗粒和杞菊地黄丸含药血清干预,采用CCK-8法检测不同含药血清对H2O2诱导的SRA01/04细胞活力的影响。分别采用蛋白质印迹法（Western Blot;WB）技术,和实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System;QPCR）技术,检测Bnip3、Nix、FUNDC1在人晶状体上皮细胞中的表达。结果:1.补青颗粒保护db/db小鼠早中期糖尿病性白内障（Diabetic Cataract,DC）的药效学研究结果1.1补青颗粒高浓度组改善db/db小鼠体重（给药2周后）,补青颗粒改善空腹血糖、血脂（P<0.05）。1.2苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin staining,HE染色）结果显示:补青颗粒对db/db小鼠早中期DC晶状体上皮细胞具有明显的修复及保护作用。1.3 CCK-8结果显示H2O2诱导下SRA01/04细胞活力下降,不同浓度补青颗粒含药血清对H2O2诱导SRA01/04细胞活力均有保护作用,且以高浓度含药血清干预时,保护作用显著（P<0.05）。2.补青颗粒延缓早中期糖尿病性白内障的受损线粒体启动机制研究结果2.1免疫组化结果显示,db/db小鼠早中期DC晶状体组织中可见线粒体自噬关键蛋白LC3及Pink1的表达,给予补青颗粒干预后两个蛋白表达均增高。2.2晶状体组织Western bolt检测结果显示,db/db小鼠晶状体组织中可见线粒体自噬相关蛋白Bnip3、Nix及FUNDC1的表达,给予补青颗粒干预后三个蛋白表达均增高（P<0.05）。2.3晶状体组织Real-time PCR检测结果显示,db/db小鼠晶状体组织中可见线粒体自噬相关蛋白Bnip3、Nix及FUNDC1的表达,给予补青颗粒干预后三个蛋白表达均增高（P<0.05）。2.4晶状体上皮细胞Western bolt检测结果显示,H2O2诱导的SRA01/04细胞可见线粒体自噬相关蛋白Bnip3、Nix及FUNDC1的表达,给予补青颗粒含药血清干预后三个蛋白表达均增高（P<0.05）。2.5晶状体上皮细胞Real-time PCR检测结果显示,H2O2诱导的SRA01/04细胞可见线粒体自噬相关蛋白Bnip3、Nix及FUNDC1的表达,给予补青颗粒含药血清干预后三个蛋白表达均增高（P<0.05）。结论:1.晶状体自噬水平下降可能引起糖尿病性白内障;2.补青颗粒对早中期糖尿病性白内障具有一定程度的保护作用;3.补青颗粒对早中期糖尿病性白内障的疗效与杞菊地黄丸相近,其中以补青颗粒高浓度组疗效最佳。4.补青颗粒可以通过上调LC3、Pink1、Bnip3、Nix、FUNDC1蛋白的表达,激活Pink1-Parkin、Bnip3/Nix和FUNDC1信号通路促进线粒体自噬,从而达到保护晶状体延缓DC的发展。