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目的:肝细胞癌是我国发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一,其对目前的化疗药物和靶向药物均存在抵抗性或耐药性,且易于复发和转移,故临床尚难取得令人满意的疗效。因此,从天然产物中寻找特异性强和低毒性的药物,以及寻找新的药物靶标,是肝癌药物治疗的研究重点。苦参碱注射液以及以苦参碱为主要成分的康艾注射液与其他化疗药物联合用于肝癌的治疗,取得了一定的疗效,但其对肝癌的具体作用及其机制并未明确。本文拟研究苦参碱对体外培养的肝癌细胞增殖活性、迁移和侵袭能力的影响,并从其对miR-199a-5p/HIF-1α/EMT信号轴以及Wnt/β-catenin通路的调控来探讨其作用机制。方法:1.分别采用MTT法、细胞克隆形成实验和Transwell实验检测苦参碱对人肝癌HepG2和Huh7细胞增殖活性、细胞克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。2.运用实时荧光定量PCR检测人正常肝细胞和肝癌细胞中miR-199a-5p的表达水平,以及苦参碱对人肝癌细胞内miR-199a-5p水平的影响;分别在肝癌细胞中转染 miR-199a-5p mimic 和 miR-199a-5p inhibitor,以过表达或敲低miR-199a-5p,观察对细胞增殖活性、迁移侵袭能力的影响,以及苦参碱的干预作用,探讨苦参碱是否通过调控miR-199a-5p影响肝癌细胞的侵袭和转移。3.通过三种软件预测miR-199a-5p的作用靶标,采用免疫印迹法进行验证,研究苦参碱和miR-199a-5p对低氧诱导因子1α蛋白表达的影响。采用Transwell实验检测苦参碱和miR-199a-5p在氯化钴模拟的低氧环境下对肝癌HepG2和Huh7细胞迁移和侵袭能力的影响。4.通过Western blotting法研究苦参碱和miR-199a-5p对HIF-1α下游信号分子Snaill、twist以及上皮间充质转化过程相关分子E-cadherin和N-cadherin的调控作用,探讨苦参碱能否通过诱导miR-199a-5p逆转肝癌细胞的EMT过程。5.采用 Western blotting 法研究苦参碱和 miR-199a-5p 对 Wnt/β-cantenin 信号通路中的关键蛋白AKT、GSK3β和β-cantenin以及相应的磷酸化蛋白的影响,探讨Wnt/β-cantenin通路是否参与苦参碱抗肝癌迁移侵袭的作用。结果:1.苦参碱降低肝癌细胞HepG2和Huh7的细胞活力,效应呈浓度依赖性,苦参碱在24h、48h和72h对HepG2细胞的半数抑制浓度依次为2369、1565和909.1 μg/mL,对Huh7细胞的半数抑制浓度依次为1355、781.8和612.8 μg/mL。苦参碱也可减少肝癌HepG2和Huh7细胞的克隆形成,400μg/mL苦参碱对HepG2细胞克隆形成的抑制率为49.49±4.68%,200μg/mL苦参碱对Huh7细胞克隆形成的抑制率为35.80±4.62%。同时,苦参碱显著抑制肝癌细胞的迁移和侵袭力,浓度为800 μg/mL时对HepG2细胞的迁移和侵袭抑制率分别为52.12±4.58%和56.58±3.43%,对Huh7细胞的迁移和侵袭抑制率分别为55.05±6.50%和60.29±5.84%。2.miR-199a-5p在人正常肝细胞系L02、肝癌HepG2和Huh7细胞中均呈低表达,且表达具有差异性。苦参碱可显著增加肝癌HepG2和Huh7细胞中miR-199a-5p的水平。转染miR-199a-5p mimic后对两种细胞的增殖活性无明显影响,对HepG2细胞迁移和侵袭能力具有显著抑制作用,抑制率分别为30.55±1.67%和30.01±3.29%,对Huh7细胞的迁移侵袭能力有轻微的促进作用,但与对照组间无显著性差异。转染miR-199a-5p inhibitor对HepG2细胞迁移侵袭能力有一定促进作用,但与对照组间无显著性差异,对Huh7细胞无明显影响。在HepG2细胞中抑制miR-199a-5p的表达后,苦参碱的抗迁移和侵袭作用明显被削弱。3.TargetScan、PicTar和miRanda三个数据库软件均预测到靶基因HIF-1αmRNA的3’UTR存在与miR-199a-5p种子序列相结合的保守位点。苦参碱在低氧环境下可抑制HepG2和Huh7细胞的迁移和侵袭,800 μg/mL苦参碱对HepG2细胞的迁移和侵袭抑制率分别为63.28±5.04%和57.82±4.75%,对Huh7细胞的迁移和侵袭抑制率分别为79.65±1.29%和86.43±0.51%;miR-199a-5p在低氧环境下可抑制HepG2细胞迁移和侵袭,抑制率分别为42.07±3.22%和37.36±5.625%;Huh7细胞转染miR-199a-5p mimic后,迁移的细胞数轻微增加,但与对照组间无显著性差异。4.在 HepG2 细胞中,苦参碱和 miR-199a-5p 均可降低 HIF-1α、Twist、Snail1和N-cadherin蛋白水平,同时增加E-cadherin蛋白水平。在Huh7细胞中,苦参碱可降低HIF-1α、N-cadherin、Snail1和β-catenin的蛋白水平,同时抑制AKT、GSK3β的磷酸化,增加E-cadherin和磷酸化的β-catenin的水平,而miR-199a-5p对HIF-1α、N-cadherin和Snail1表达均无明显影响,但显著抑制E-cadherin表达,增加twist表达水平。结论:1.苦参碱能抑制肝癌HepG2和Huh7细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭活性。其直接的细胞毒性在较高浓度时发生,而抗迁移和侵袭作用表现更为显著,在较低浓度时即可发生。2.苦参碱能上调两种肝癌细胞中miR-199a-5p的表达;HepG2细胞内过表达miR-199a-5p可抑制细胞的迁移和侵袭能力,Huh7细胞内过表达miR-199a-5p对细胞的迁移和侵袭能力无明显作用;当敲低细胞内miR-199a-5p水平后,苦参碱对HepG2细胞迁移和侵袭能力的抑制作用被削弱。miR-199a-5p对肝癌细胞的增殖活性无明显影响。结果表明苦参碱可能通过诱导miR-199a-5p的表达抑制HepG2细胞迁移和侵袭的能力。3.苦参碱在低氧环境下对HepG2和Huh7细胞迁移和侵袭的抑制作用较常氧环境下更强;miR-199a-5p对低氧HepG2细胞的迁移和侵袭的抑制作用较常氧环境下更强,对低氧Huh7细胞无明显作用。苦参碱在HepG2细胞中可能通过诱导miR-199a-5p表达,抑制HIF-1α和下游Twist及Snail1的表达,进而抑制EMT的发生,产生抗迁移和侵袭作用。苦参碱在Huh7细胞中可能通过抑制AKT的磷酸化,从而降低HIF-1α的表达水平,同时抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路,进而抑制EMT的发生,实现其抗迁移侵袭作用。