类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种免疫应答介导的慢性自身免疫性疾病,主要病理特征是滑膜组织增生、形成血管翳、骨和软骨组织结构不可逆破坏。临床上以起病缓慢、病程长、致残率高、且可累及多个器官为特征,严重影响了患者的身体健康和生命质量。　　 RA的发病因为还不完全清楚。近年来研究人员对RA较多的认识是滑膜组织中的成纤维样滑膜细胞的活化和增生,在RA的发病中起着重要作用。成纤维样滑膜细胞是构成滑膜的主要细胞,可通过分泌多种细胞因子、蛋白酶类等破坏关节结构,以及血管内皮增生、新血管生成,促进血管翳的形成。　　 中医认为RA属痹证范畴,正气不足和风寒湿邪乘虚伤人是致病的内因,而邪气闭塞,经络闭阻是其病机,最终导致血瘀。中药治疗类风湿积累了丰富的经验,主要是活血化瘀,祛风除湿,活血化瘀药物可以通过下调VEGF的表达而阻抑关节滑膜血管翳的形成或骨侵蚀。　　 穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣的干燥根茎,其有效成分主要为甾体皂苷类,研究表明穿山龙具有活血化瘀、补益气血等作用,主治风寒湿痹、消化不良、劳损扭伤、痈肿等。临床用于治疗冠心病、抗动脉粥样硬化、降血脂、抗肿瘤等,民间用于治疗RA有显著疗效。本研究通过观察穿山龙总皂苷对炎性因子IL-1β、IL-17和TNF-α联合诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌VEGF的影响以及吡咯烷二硫代氨基甲酸(Pyrrolidinedithiocarboxylic acid sodium salt dehydrate,PDTC)阻断NF-κ3信号通路后的作用,以此探讨穿山龙总皂苷治疗RA的作用机制,为穿山龙总皂苷进一步研究提供实验基础。　　 目的:研究穿山龙总皂苷对IL-1、IL-17和TNF-α联合诱导大鼠滑膜细胞RSC-364 VEGF的产生及其分泌相关信号通路NF-κB的影响　　 方法:　　 1.大鼠滑膜细胞的培养与鉴定　　 大鼠滑膜细胞株RSC-364用10％胎牛血清-DMEM制成悬液接种于培养瓶中,于37℃、5％CO2培养箱中培养。采用Vimentin蛋白链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物免疫组织化学法对大鼠滑膜细胞进行鉴定。　　 2.穿山龙总皂苷含药血清对RSC-364细胞的影响　　 取对数生长期的RSC-364细胞(2×104/ml)2001μl,加入不同浓度的穿山龙总皂苷含药血清(5％、10％、20％、30％、40％和50％)培养48h后,每孔加入MTT(5mg/ml)20μl培养4h后弃上清,每孔加DMSO150μl,震荡10min,540nm波长测定OD测定细胞存活率；对照组平行分别加入5％-50％大鼠血清,通过细胞存活率测定穿山龙总皂苷含药血清对RSC-364细胞的影响。　　 3.IL-1β、IL-17联合TNF-α诱导RSC-364细胞分泌VEGF　　 取对数生长期的RSC-364细胞(2×104/ml),每孔1000μl加入24孔板培养3h,分别在孔中加入IL-1β(10μg/L)+IL-17(10μg/L)、IL-1β(10μg/L)+TNF-α(10μg/L)、IL-17(10μg/L)＋TNF-α(10μg/L),于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养24小时后取上清,采用ELISA试剂盒测定IL-1、IL-17联合TNF-α诱导RSC-364产生VEGF的水平。　　 4.PDTC对滑膜细胞分泌VEGF相关信号通路NF—κB的影响　　 取对数生长期的RSC-364细胞(2×104/ml),每孔2000μl加入放有盖玻片6孔板培养3h,加入TNF-α(10μg/L)+IL-17(10μg/L)孵育1h,再加入PDTC(10μg/L)培养24h,取上清用ELISA免疫试剂法测定VEGF的水平。取出盖玻片4℃丙酮固定,用免疫组化实验方法观察NF-κB的表达情况。　　 5.穿山龙总皂苷含药血清对TNF-α+IL-17联合诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌VEGF的影响　　 取对数生长期的RSC-364细胞(2×104/ml),每孔1000μl加入24孔板培养3h,加入穿山龙含药血清(10％、20％和30％),培养1h后加入TNF-α(10μg/L)+IL-17(10μg/L),培养24h,取上清利用ELISA免疫试剂法测定VEGF的水平。　　 6.穿山龙总皂苷含药血清对TNF-α+IL-17联合刺激大鼠滑膜细胞株RSC-364对VEGF分泌信号通路NF-κB的影响　　 取对数生长期的RSC-364细胞(2×104/ml),每孔2000μl加入放有盖玻片的6孔板中培养24h,分别加入穿山龙含药血清(10％、20％和40％)、含药血清孵育1h后加入FNF-α(10μg/L)+IL-17(10μg/L),培养24h,取出盖玻片,用免疫组染色法检测NF-κB的表达。　　 结果:　　 1.大鼠滑膜细胞的鉴定　　 镜下观察到大鼠滑膜细胞RSC-364呈梭形或三角形,蜂窝状生长。采用Vimentin蛋白链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物免疫组织化学特异性鉴定,观察到RSC-364细胞核蓝染,胞浆内含棕黄色颗粒,为滑膜B细胞的特征染色。　　 2.穿山龙总皂苷含药血清对RSC-364细胞　　 不同穿山龙总皂苷含药血清与RSC-364细胞孵育24h后,与空白对照组比较,5％、10％、20％和30％浓度的穿山龙总皂苷含药血清对RSC-364细胞没有明显毒性,但40％和50％穿山龙总皂苷含药血清对RSC-364细胞表现出明显毒性,细胞存活率显著降低。　　 3.IL-1β、IL-17联合TNF-α诱导RSC-364细胞分泌VEGF的测定　　 与空白对照组比较,IL-1β+IL-17组、TNF-α+IL-17组、TNF-α+IL-1β组诱导的RSC-364细胞分泌VEGF均明显增高,具有显著性差异(P<0.01),且TNF-α+IL-17诱导RSC-364细胞分泌VEGF高于IL-1β+IL-17组和TNF-α+IL-1β组。　　 4.PDTC对滑膜细胞分泌VEGF相关信号通路NF-κB的影响　　 与空白对照组比较,TNF-α+IL-17组细胞培养液中VEGF水平显著升高；NF-κB信号通路阻断剂PDTC明显降低培养液中VEGF的水平。免疫组化检测RSC-364细胞NF-κB/p65表达结果发现,TNF-α+IL-17组细胞核蓝染,胞浆内聚集大量棕色颗粒,而加PDTC组细胞浆内没有棕色颗粒聚集。　　 5.穿山龙总皂苷含药血清对TNF-α+IL-17诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌VEGF的影响　　 与空白对照组比较,TNF-α+IL-17组细胞培养液中VEGF水平显著升高,而三剂量含药血清药物组培养液中VEGF水平皆有所降低,但只有中剂量(20％含药血清)具有统计学意义。　　 5.穿山龙总皂苷含药血清对RSC-364细胞NF-κB信号通路的影响空白对照组细胞NF-κB表达阴性,而TNF-α+IL-17刺激下NF-κB阳性细胞数明显增多,三剂量穿山龙含药血清明显降低RSC-364细胞的NF-κB阳性细胞数,下调NF-κB/p65蛋白的表达,且中剂量效果最高。　　 结论:　　 1.穿山龙总皂苷含药血清在30％以下浓度对大鼠滑膜细胞株RSC-364不显示毒性,但超过40％浓度对RSC-364有毒性。　　 2.IL-1β、IL-17联合TNF-α能够诱导RSC-364细胞分泌VEGF,且IL-17+TNF-α诱导作用最强。　　 3.PDTC能够降低IL-17+TNF-α诱导RSC-364细胞VEGF的产生,降低NF-κB表达,表明RSC-364细胞对VEGF的产生是通过NF-κB信号通路介导的。　　 4.穿山龙总皂苷能够抑制炎性因子诱导RSC-364细胞VEGF的分泌,且是通过抑制NF-κB信号通路介导的。　　 5.穿山龙总皂苷可下调NF-κB/p65蛋白的表达,降低炎症因子诱导VEGF的产生。提示穿山龙治疗RA可能是通过抑制滑膜细胞血管生成而发挥作用的。