癌症是一个高度复杂且多基因相关的疾病,它涉及到多重交叉的细胞信号通路和异常细胞生长,比如原癌基因异常表达和各种激酶的调节异常,具有侵入或扩散到身体其他部位的可能性。根据2012年全球癌症统计数据显示^[1],癌症给人类带来的危害是惊人的。因此,发现新型生物靶点和更具体化疗药物的研究是目前研究的热门,尤其是对大多数侵袭性肿瘤。溴结构域蛋白4（BRD4）表达水平失调或功能紊乱与多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、以及乳腺癌、结肠癌和肺癌等有密切关系^[2]。它参与上皮间质转化,干细胞样转化过程。BRD4抑制剂可以诱导上述肿瘤发生细胞周期阻滞,凋亡及细胞分化。显示出强大的抗肿瘤活性。因此BRD4是目前研究最热门的靶点之一。作为BRDs成员之一的溴结构域蛋白4（BRD4）主要通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ和形成融合蛋白两种方式来调控癌基因c-Myc的表达,从而影响肿瘤细胞的增值和细胞周期。正常情况下,BRD4基因剪切形成两种不同的亚型——分别命名为短亚型和长亚型。两个BD结构域（BDI,BDII）、一个ET结构域、一个富含丝氨酸的SEED结构和富含脯氨酸的C-末端区共同构成长亚型的BRD4。与长亚型的BRD4不同的是,短亚型BRD4没有富含脯氨酸的结构域。BRD4通过与乙酰化组蛋白H3 Lys-14,H4 Lys-5/8/12结合的方式,诱导其他染色质对相关的组蛋白进行修饰,从而调控靶基因的表达。除此之外,BRD4还能够通过与乙酰化的非组蛋白结合的方式来影响基因转录与翻译、细胞增殖和细胞周期等。因此新型BRD4小分子抑制剂的研究迫在眉睫并引起了全世界科研工作者的强烈兴趣。新型BRD4小分子抑制剂的研究取得了巨大成果。BRD4小分子抑制剂目前主要包括三氮唑类、异恶唑类、吡啶酮、嘧啶酮类和其他类四大类。本课题组选择了一个具有300万个化合物的化合物库进行计算机虚拟筛选,得出前10%化合物,结合之前的报道,我们设计了二氢吲哚-2-酮母核,根据不同的取代基合成了28个新型化合物。我们对这些化合物通过MTT法检测体外抗肿瘤活性,激酶法检测其选择性。^[12-16]。本论文主要研究内容如下:1.目标化合物的设计本课题组选择了一个具有300万个化合物的化合物库进行计算机虚拟筛选,得出前10%化合物,再结合之前的报道进行了简单的构效关系总结与分析,我们设计了二氢吲哚-2-酮母核,并根据不同的取代基合成了28个新型化合物,把它们分成a系列、b系列、c系列和d系列四类。2.目标化合物的合成及结构鉴定本论文以以5-硝基吲哚-2-酮为原料,经过硝基的还原反应、亲核取代反应和羟醛缩合反应得到a系列化合物;以哌啶为原料,经过酸酐的胺解反应、酰胺缩合反应和羟醛缩合反应,得到b系列化合物;以4-（4-叔丁氧羰基）哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸为原料,经过酰胺缩合反应和羟醛缩合反应,得到c系列化合物;以硫代吗啉为原料,经过酸酐的胺解反应和羟醛缩合反应,得到d系列化合物。并并经高分辨质谱HRMS（ESI-MS）、核磁共振氢谱（¹H-NMR）、核磁共振碳谱(¹³C-NMR)实验表征其结构。3.目标化合物的初步抗肿瘤活性筛选用MTT法（噻唑蓝比色法）测定新合成化合物对人乳腺癌细胞株（MCF-7）、人结肠癌细胞株（HT-29）和人肺癌细胞（A549）的体外增殖抑制活性。以3×10³个细胞/孔在96孔板中培养条件良好的细胞,用完全培养基培养过夜后,用梯度稀释法将化合物稀释至40、20、10、5、2.5和1.25μM,然后在每个孔中加入100μl稀释药物溶液,每种浓度设置3个复制孔,每种浓度100μl完整。同时将培养基加入对照组,以阿霉素为阳性对照,按化合物稀释,37℃下5%CO₂下培养皿,在培养箱中培养48小时。然后用20μl MTT溶液（5 mg/ml）处理各孔,继续培养4h,丢弃上清液,每孔加入150μl DMSO。在570nm处测量吸光度（A）,根据以下公式计算靶化合物对肿瘤细胞的抑制率^[17]。相对细胞增殖抑制率（%）=（对照组A570-实验组A570）/对照组A570×100%。采用SPSS软件计算半值抑制(IC₅₀)。4.激酶法检测d-9的选择性激酶选择性是影响BRD4小分子抑制剂有效性的关键因素。因此,通过测定6种激酶活性来评价化合物d-9的激酶选择性。化合物d-9的激酶测定是利用wizards化学公司提供的激酶谱分析服务进行的。化合物d-9对BRD4表现出明显的选择性,IC₅₀为0.83μM,而对JAK1和MEK1的IC₅₀分别为485μM、6820μM。然而,我们发现化合物d-9对FLT-3激酶也具有一定的特异性,可通过进一步的结构优化获得选择性更好的小分子抑制剂。