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纤维素是自然界中分布最广、数量最多的天然可再生碳水化合物,是D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接组成的线性大分子。纤维素酶是能降解纤维素的多种酶系的统称,属于糖基水解酶家族。依据作用方式不同大致可以三类：内切葡萄糖苷酶、外切葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶。三类酶相互协同作用,将纤维素最终水解为葡萄糖。由于天然的微生物产纤维素酶量少、发酵条件复杂等原因,需要构建基因高产纤维素酶的工程菌。本论文具体的研究工作有：1、验证基因组DNA中内切葡聚糖酶基因egⅠ的存在。先提取DNA,采用PCR技术克隆到egⅠ基因,再将egⅠ连接到PMD18-T载体,连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株,挑取阳性克隆测序。测序结果显示内切葡聚糖酶基因(egⅠ-DNA)大小为833bp,在NCBI上比对后,用序列分析软件Vector NTI比对后发现该基因含有2个内含子和3个外显子,三个碱基发生突变。2、提取土曲霉M11 RNA,利用RT-PCR的方法,从土曲霉M11中克隆出了egⅠ的cDNA序列,测序结果显示egⅠ的cDNA序列的编码区为705bp,正好是DNA序列去除内含子后的外显子长度。3、构建表达载体。使用限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ消化pmd18T-egⅠ。将目的基因小片段连接到经过同样的内切酶双酶切的空穿梭载体载体pPIC9K。将连接产物转化到大肠杆菌中验证载体的构建。4、将重组表达载体电转化到毕赤酵母GS115中,在甲醇的诱导下,酶得到表达。5、优化工程菌的发酵条件：如重组工程菌培养温度、初始pH、甲醇的浓度、摇床的转速、培养时间等。6、重组酶的性质的初步研究：分别研究了粗酶液的最适反应温度、最适反应pH、热稳定性、pH稳定性、金属离子对酶活性的影响等。