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目的:耳聋是全球也是我国的重大公共卫生问题,研究认为耳聋由遗传和环境因素共同引起,其中约50%-60%的耳聋由遗传因素引起。遗传性耳聋（Hereditarydeafness）对患者生活质量和社会发展有着较大的影响,而基因功能的异常在遗传性耳聋的发生发展中起着十分重要的作用。因此,发现新的耳聋相关基因并进一步探讨其致聋机制显得尤为重要。本研究以一耳聋家系为出发点,旨在发现新的耳聋相关基因,开展遗传性耳聋发生机制的研究。方法:1.耳聋家系的筛查和耳聋相关基因的筛选与鉴定:对先证者及其家系成员进行纯音听阈测试,采用全外显子测序（WES）技术对先证者的基因外显子做序列分析;按照ACMG（American College of Medical Genetics）分级标准筛选致病性变异位点,利用聚合酶链式反应（PCR）和Sanger测序法进行验证。2.Tyk2敲除小鼠模型的构建与鉴定、耳聋与耳蜗病理等观察:以CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除小鼠Tyk2基因,通过PCR-琼脂糖凝胶电泳鉴别纯合型小鼠（Tyk2-/-）、野生型小鼠（Tyk2+/+）和杂合型小鼠（Tyk2+/-）;Western blot检测TYK2蛋白在内耳的的表达;免疫组化对TYK2蛋白在耳蜗组织的表达做定位分析;测试10周龄纯合型和野生型小鼠的听觉脑干反应（auditory brainstem-response,ABR）阈值,观察小鼠听力的改变;用鬼笔环肽-488染色毛细胞纤毛束以观察10周龄纯合型和野生型小鼠外毛细胞的形态改变;Western blot 检测内耳 STAT3、p-STAT3、抗凋亡蛋白（Bcl-2）和 Cleaved-caspase12 的表达变化。3.Tyk2敲低细胞模型的构建和TYK2相关信号转导通路的观察:设计两个慢病毒载体（shRNA-2932和shRNA-NC）分别感染HEI-OC1细胞构建Tyk2低表达细胞模型,荧光显微镜和流式细胞仪观察感染效率;Western blot 检测 TYK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和 Cleaved-caspase12 的表达变化;CCK-8试剂盒检测细胞的增殖能力。结果:1.耳聋家系的筛查和耳聋相关基因的筛选与鉴定:①纯音听阈检测显示先证者为双侧中度至极重度感音神经性聋,Ⅱ1为双侧中度至重度感音神经性聋,Ⅱ2为双侧对称性中度混合性聋,Ⅱ5表现为双侧重度至极重度感音神经性聋。②对先证者基因组进行全外显子测序,共筛选出6个耳聋候选基因,分别是 TYK2、NESTIN、TBC1D28、FOXD4L3、ESRRB1 和 ESRRB2。③Sanger 测序对先证者及其家系其他成员的基因突变进行验证,其中TYK2基因突变[c.2107C＞T（p.R703W）]NESTIN基因突变得到证实,其余基因突变点未证实。NESTIN是已知的耳聋相关基因,而TYK2基因与耳聋关系未见报道。2.Tyk2敲除小鼠模型的构建与鉴定、耳聋与耳蜗病理等观察:①取已制备的Tyk2-CRISPR-Cas9敲除小鼠尾尖,提取因组DNA,PCR-琼脂糖凝胶电泳成功鉴定出Tyk2--小鼠和Tyk2+/+小鼠。②Westernblot和免疫组化检测发现,TYK2蛋白在Tyk2+/+小鼠内耳的正常表达,然而在Tyk2-/-小鼠内耳表达缺失;免疫组化定位显示TYK2在耳蜗毛细胞（HCs）、螺旋神经元（SGNs）和血管纹（SV）均有表达。③10周龄Tyk2-/-小鼠与Tyk2+/+小鼠相比,不同音频刺激下的ABR阈值明显升高,而32 kHz音频刺激下的ABR阈值显著性升高（P＜0.01）,提示Tyk2-/-小鼠听力受损。④毛细胞纤毛束染色发现,Tyk2-/-小鼠耳蜗底回外毛细胞有散在丢失,而Tyk2+/+小鼠的毛细胞形态正常。⑤Western blot结果显示,10周龄时Tyk2-/-小鼠内耳STAT3、p-STAT3和Bcl-2水平降低,而活化的Caspase12水平升高。3.Tyk2敲低细胞模型的构建和TYK2相关信号转导通路的观察:①shRNA慢病毒感染HEI-OC1细胞96h后,荧光显微镜观察细胞感染率约70%,经6μg/ml的Puromycin筛选一周后,流式细胞仪检测发现感染效率接近100%。②qRT-PCR和Western blot证实,与shRNA-NC组相比,shRNA-2932感染细胞TYK2的表达量降低。③Western blot结果证实,shRNA-2932感染细胞中STAT3、p-STAT3和Bcl-2水平降低,活化Caspase12水平升高。④CCK-8试剂盒检测显示,shRNA-2932感染细胞增殖能力下降。结论:通过全外显子测序,从一耳聋家系发现了一新的耳聋相关基因-TYK2,成功构建了Tyk2-CRISPR-Cas9敲除小鼠模型;Tyk2-/-小鼠出现听力受损和耳蜗毛细胞损害;TYK2-STAT3-Bcl-2信号通路失调可能是导致TYK2基因突变者耳聋发生的重要因素。本研究可望为揭示遗传性耳聋的发病机制提供新的实验依据。