肝移植通过半个多世纪的应用,已被证实为终末期肝病最有效的治疗方法,但供体的缺乏导致许多终末期肝病患者在等待中死亡,拓展供肝来源是移植领域一个无法回避的话题。心脏死亡捐献(donation after cardiac death,DCD)供肝的大量使用虽然有利于扩大供肝来源,但该类供体常伴有更长时间的热缺血损伤,因此移植后缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)较脑死亡供肝更严重,从而导致移植术后肝原发性无功能(primary non-function,PNF)、胆道缺血性病变等严重术后并发症的发生率明显升高。因此,改进DCD供体器官的保存方式,减轻供体器官IRI,优化器官质量目前越来越受到学术界的关注。低温机械灌注(hypothermic machine perfusion,HMP)是一种低温条件下的器官动态保存技术,其主要特点在于模拟生理状态下血液在肝脏内的血流动力学特点,通过循环灌注持续向肝脏组织提供氧气和营养物质,满足在低温条件下的代谢需要,同时清除残留在血管内部的杂质保持血管的通畅性,从而有效改善供肝质量。HMP已被大量临床和基础实验证实可以较传统冷保存技术更为有效的减轻DCD供肝IRI,改善供肝质量,但其具体的相关分子生物学机制尚没有得到完全阐述。大量研究证实,SIRT-1(NAD+依赖的去乙酰化酶沉默信息调节因子2相关酶I)可以通过去乙酰化修饰调控目标蛋白,减轻脏器IRI。但SIRT-1的活性与呼吸链NAD+水平呈正相关。结合HMP可以有效改善DCD供肝缺氧状态的特点,我们推测HMP可能存在诱导SIRT-1的活性提高减轻DCD供肝IRI的机制。因此本课题首先建立了基于Lifeport改装大鼠肝脏HMP系统,并研究了 DCD供肝的HMP流体动力学灌注规律对于肝脏IRI标志物的影响,在此基础上对HMP是否可以通过SIRT-1/NFκB-p65通路减轻DCD肝脏的IRI进行研究。第一部分Lifeport改装大鼠肝脏低温机械灌注系统研究目的:HMP技术保护供肝的分子机制尚未完全得到阐述。缺少一种便携通用的大鼠肝脏HMP系统是限制相关研究的主要原因之一。本研究旨在通过对Lifeport Kidney Transporter(Lifeport)进行改装,在保留Lifeport原有的便携,自动化特点的同时完全实现大鼠肝脏HMP。方法:将自制“Y”形分流管的“C”端连接Lifeport,“A”端通过压力感受器与大鼠门静脉插管相连以便监测灌注压,“B”端通过分流肝脏灌注流量达到降低灌注压力的目的。大鼠肝脏灌注槽下置放一迷你电子秤,通过槽内一分钟灌注液重量的变化,根据液体重量,密度和体积的关系,换算出每分钟灌注流量。灌注过程采用“Prime”模式实现持续灌注。实验中采用10只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,获取肝脏后灌注时间均为6 小时,灌注液为 HTK+吖陡橙(acridine orange,AO)+ 碘化丙陡(propidium iodide,PI)混合液,流量0.5ml/g/min。通过比较肝脏中央区(core region,CR)和边缘区(peripheral region,PR)的 AO+PI 细胞染色总数(AO+PI positive cell count,APPCC)评价该改装系统是否实现完全灌注。灌注过程中监测灌注压力,流量,温度,同时每3小时获取灌注液检测肝功能ALT,LDH,内皮素,氧耗率。灌注结束后对肝脏组织ATP水平检测并记录胆汁生成率。此外,对PR区灌注前后的肝脏组织的病理学评分进行比较并且评价HMP对于肝脏组织的影响。结果:6小时HMP结束后,CR和PR区域APPCC之间没有统计学差异,提示该系统在流量0.5ml/g/min的情况下实现了完全灌注。灌注阻力指数前3小时呈显著下降趋势,之后一直平稳持续到灌注结束。随着灌注时间延长,灌注液中ALT从34.75 ±17.96升至145.14±13.13 U/L(P<0.01),LDH从422.65±167.97 升至 1865.59±160.50U/L(P<0.01)。整个HMP过程中,肝脏氧耗率和灌注液中内皮素水平变化无统计学差异。灌注后组织学评分提示虽然肝窦明显扩张,但较灌注前并没有发现更严重的内皮细胞损伤,而且细胞空泡化水肿情况并没有加重。灌注结束后肝脏ATP的水平为638.47±50.41 nmol/L,胆汁生存率 4.37±0.77 μL/h/g liver。结论:本实验研究证实基于Lifeport改装的大鼠肝脏HMP系统在保留Lifeport机原有便携性,自动化特点的同时,参照现有文献报道的最佳灌注条件实现完全灌注,而且将灌注相关性物理损伤降到最低,以利于最大限度发挥HMP的优势。第二部分低温机械灌注的不均匀性对大鼠心脏死亡供肝缺血再灌注损伤标志物的影响目的:心脏死亡(donation after cardiac death,DCD)供肝不同部位微循环障碍的差异导致HMP灌注的不均匀性。本实验旨在对HMP灌注的不均匀性对相关区域缺血再灌注损伤的标志物影响进行研究。方法:10只SD成年雄性大鼠,心脏停跳30分钟后获取肝脏随机分为冷保存组(cold storage,CS)和低温机械灌注组(hypothermic machine perfusion,HMP),每组各 5 只。获取肝脏分为中央区(coreregion,CR)和边缘区(peripheral region,PR),CS组肝脏HTK液保存3h后直接使用吖陡橙(acridine orange,AO)+碘化丙陡(propidium iodide,PI)组织染色,HMP组灌注液使用HTK+AO+PI混合液,通过比较CS组和HMP组在CR,PR 区域 AO+PI 细胞染色总数(AO+PI positive cell count,APPCC)评价 HMP 组是否实现完全灌注。再将两组获取肝脏分为淤血区和无淤血区,并获取标本,分别检测上述区域Krppel样转录因子2(KLF2),超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),ATP,NF-κB-p65,IL-1β,TNF-α 的水平。结果:由于CS组采用AO+PI直接染色,所以可以作为100%灌注对照组。两组在CR,PR区域APPCC未见统计学差异(P>0.05),提示HMP组实现完全灌注。KLF2由于与灌注流量直接相关,可以间接反应淤血区域和无淤血区域之间的灌注阻力的区别,实验发现HMP组整体表达强于CS组,特别是HMP组无淤血区域表达最高(P<0.05),提示该区域灌注阻力最低。与之对应,与CS组比较,HMP组ATP,SOD水平,肝脏病理学表现均明显改善,MDA,NF-κB-p65,IL-1β,TNF-α呈显著下降趋势,其中HMP组中无淤血区域上述指标改变最为明显。结论:HMP对于DCD供肝灌注的不均匀性导致其对于肝脏无淤血和淤血区域IRI标志物的影响存在差异。HMP组肝脏质量整体优于CS组,此外与淤血区比较,HMP组无淤血区肝脏ATP,SOD水平明显升高,组织形态学表现更为理想,而MDA,NF-κB-p65,IL-1β,TNF-α 的水平显著下降。第三部分低温机械灌注诱导SIRT-1去乙酰化NFκB-p65抑制其活性减轻大鼠心脏死亡供肝移植后缺血再灌注损伤目的:探讨HMP减轻大鼠DCD供肝移植后缺血再灌注损伤炎症反应的机制。方法:10只成年SD雄性大鼠随机分为CS组和HMP组(每组5只),心脏停跳30min后大鼠肝脏分别给予CS或HMP保存3h,之后采用大鼠离体常温复灌系统模拟肝移植后再灌注过程2h。复灌过程中,肝脏阻力指数,灌注液中肝酶活性,肝脏氧耗率,胆汁生成量分别进行记录。复灌结束后,肝脏组织分别行HE染色,ATP,丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD),NAD+水平和NAD+/NADH比例检测。Western blot测定肝脏组织中SIRT-1,NFκB-p65,乙酰化NFκB-p65蛋白表达水平。荧光定量PCR检查组织内IL-6,TNF-α的mRNA表达水平。结果:虽然胆汁生成率在两组间没有统计学差异,但与CS组比较,HMP组肝脏复灌阻力指数、肝酶、MDA水平明显较低,O2消耗率、ATP及SOD水平明显提高,组织学形态较好,而且NFκB-p65的蛋白表达水平,炎症因子TNF-α和IL-6的mRNA表达水平明显下降(P<0.05)。另外,伴随着其活性指标NAD+水平和NAD+/NADH比例的显著上升,HMP组SIRT-1的表达和其活性明显上升,与之相关的乙酰化NFκB-p65的蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论:HMP通过提高SIRT-1的表达和活性,去乙酰化抑制NFκB-p65介导的炎症反应从而减轻大鼠DCD供肝移植后缺血再灌注损伤。