目的:肾单位是肾滤过血液并排泄代谢终产物的结构和功能基本单位,由滤过血液的肾小球和重吸收超滤液的肾小管组成,肾小管分为近端小管、细段和远端小管。尽管肾小球超滤液大部分在近端小管重吸收,远端小管对超滤液的微量吸收及分泌却对血液酸碱平衡及机体水容量调节起至关重要的作用。此功能的实现依赖于分布在远端小管及集合管的膜转运体对钠、钾、钙等离子及水的吸收,以及对H~+、OH~-/HCO3~-等离子的分泌。在结构上,肾单位的最远端——远曲小管通过连接小管与集合管相连通,延续肾单位对超滤液的调节及排泄。连接小管,无论结构还是功能,兼具远曲小管和集合管的特征。其构成除了连接小管特异的细胞——连接小管细胞外,穿插有远曲小管细胞、集合管的主细胞和闰细胞。其中,远曲小管细胞具有钠氯共转运体(Natrium Chlorinum Cotransporter,NCC);主细胞具有水通道蛋白2(Aquaporin2,AQP2);闰细胞具有质子ATP酶(H~+-ATPase);连接小管细胞具有钙结合蛋白(Calbindin)、激肽释放酶(Kallikrein)、上皮钠通道(Epithelial Natrium Channel,ENaC)等。由此可见,连接小管具有诸多生理功能,但连接小管(肾单位和集合管连接部)的起源、管腔的通连及其功能还有待于进一步研究及证实。肾的发生成于两个结构的相互诱导:起于中肾管的输尿管芽和后肾间充质。前者发育为各级集合管,后者发育为肾单位。后者先后经历了肾囊泡(小泡体)期、逗号小体期、S型小体期、肾小球血管襻形成期、肾小体成熟期五期。输尿管芽泡与发育早期的肾单位相连,连通的部分延伸、分化发育为成年连接小管。近年,高通量基因检测技术显示肾单位远端细胞活跃增殖并侵入输尿管芽上皮是两个结构相连的初级阶段。然而,两者相连后如何延伸、何时出现管腔并发育为连接小管仍是未解之谜。尤其是在开始连接处细胞活动的详细信息可视化研究是非常有限的。本研究在组织学连续切片并染色基础上,采用计算机图像处理及目标结构程序追踪技术,三维重建肾单位远端部分包括远曲小管和连接小管的形态发生;并在此基础上通过电镜和免疫组织化学技术,显示远端肾单位和集合管连接部的细胞详细信息和起源;远曲小管、连接小管和集合管膜转运体分布,旨在探索肾单位远端的发生及功能分化的时空性,为肾病因学及治疗学的研究提供组织细胞学依据。研究方法:心脏灌流固定后,获取小鼠不同时间点肾组织2.5μm厚树脂(E14.5,E17.5,P7)连续切片。采用图像采集系统将连续切片转为数字显微图像后,经自编软件配准,再输入到计算机Linux系统,借助自主研发的C语言程序实现小管数字追踪。将追踪得到的坐标数据集输入到三维可视软件中,显示集合管与肾单位的连接部及其空间走行及毗邻关系。E17.5昆明小鼠肾组织,制备成树脂812包埋块,垂直肾长轴从肾被膜到肾乳头连续半薄切片(2.5μm),甲苯胺蓝染色。采用TDI线性扫描系统对整张切片进行扫描,用已建立的图像配准算法对连续切片的序列图像进行对齐,获取高分辨率数字显微图像集。选取连续切片中目标切片,树脂倒扣再包埋,获取50nm超薄切片,透射电镜下观察肾单位与集合管连接部超微结构特点。取P7 1μm厚半薄切片,采用适当浓度的强碱溶液蚀刻环氧树脂以暴露抗原,并应用高温高压加热以提高其抗原性,采用免疫组织化学法检测膜转运体NCC的表达。取各龄胎鼠(E12.5、E14.5、E16.5、E18.5)及仔鼠(P1、P3、P7、P14、P21、P28、P40)肾组织,常规固定、脱水、透明、石蜡包埋、5μm厚的连续切片,应用高温高压加热修复抗原,采用改良的免疫组织化学法和体视学面数密度分析方法检测膜转运体NCC、AQP2和H~+-ATPase的表达。结果:1、膜转运体在发生发育的远曲小管和集合管的表达。三个膜转运体的表达都从E14.5天开始。NCC和AQP2表达在细胞膜的游离面;H~+-ATPase或表达在细胞的游离面(A型闰细胞),或表达在细胞的游离面和胞质内(nonA-nonB型闰细胞),或表达在细胞的基底面和胞质(B型闰细胞)。小泡体期、逗号小体期和S小体期输尿管芽和和肾单位连接部及输尿管芽泡上无三种膜转运体的表达。2、NCC分布在发生发育的远曲小管。E14.5天,NCC较弱地表达在发生发育中的远曲小管,此时远曲小管的细胞呈现出幼稚细胞的特征——核较大,胞浆较少。从E16.5天开始,NCC既表达于发育中的远曲小管,又表达于较为成熟的远曲小管,并且随着肾单位的发育,NCC表达阳性的小管形态趋于成年肾的远曲小管形态——核靠近细胞质近腔面,核下方可见基底纵纹。NCC在远曲小管腔面呈环状或半环状表达。3、AQP2表达在发生发育集合管。AQP2在各个发育的时间点上都表达在与较为成熟的肾单位相连的集合管上,与发生早期的肾单位相连的输尿管芽上表达微弱或无表达。随着肾脏髓质的发育,AQP2主要分布于髓质集合管,内髓处的集合管上AQP2阳性细胞基本构成整个管腔。而皮质被膜下及髓放线中,AQP2阳性细胞分散分布在集合管上。4、H~+-ATPase表达在较为成熟的远曲小管末端和集合管,H~+-ATPase在集合管的分布与AQP2的分布形成互补。因此,H~+-ATPase主要分布于皮质集合管,在髓质集合管很少,呈散点状分布。此外,A型和nonA-nonB型闰细胞主要分布在远曲小管末端和集合管;B型闰细胞主要分布于皮质集合管。5、AQP2和H~+-ATPase表达的体视学分析结果为:AQP2和H~+-ATPase阳性表达于皮、髓质集合管的面数密度(N_A)随着肾脏发育均增加,但是,皮质以H~+-ATPase增加为主,而髓质以AQP2增加为主。6、连接小管(肾单位和集合管连接部)的发生及膜转运体的表达。本研究电镜显示肾单位和集合管开始连接处是由一群细胞构成的,这些细胞源于最年轻的肾单位—肾小泡体,并在终末输尿管芽顶部的基底部呈斑片状粘附。根据对2.5μm厚的连续树脂切片的小管追踪可鉴别出肾小泡体和输尿管芽。此处细胞的特点为:细胞形态高度不规则,顶部胞质突起呈指状、边缘皱褶甚至出现板状伪足;细胞核电子密度高;丰富的细胞内和细胞间空隙;广泛的细胞和细胞之间的局部接触,具有各种细胞连接,偶尔可见相对质膜的不连续融合,胞质内可见大量线粒体、致密包裹的玫瑰样的多聚核糖体、粗面内质网和微管。而且追踪过程中发现终末输尿管芽顶部通常连接两个处于不同发育阶段的肾单位。输尿管芽顶部和与小泡体或S小体期相连的连接部没有三种膜转运体的表达,但是在毛细血管袢期的不成熟的连接小管可见他们的表达。结论:1、三种膜转运体NCC、H~+-ATPase和AQP2都在E14.5天出现。表达三种膜转运体的细胞形态结构仍处于发育时期,表现出核浆比大,提示E14.5天开始远曲小管和集合管功能分化已初步形成,但是结构还没有发育成熟。2、随着肾髓质的发生发育,AQP2和H~+-ATPase在集合管上的分布呈节段性,即表达H~+-ATPase的闰细胞以皮质集合管分布为主,而表达AQP2的主细胞以髓质集合管分布为主,提示两种细胞对水及酸碱平衡的调节有区域性差异。3、输尿管芽顶部和开始连接处的细胞特点反应了此处对能量和蛋白质产生的高需求,细胞之间通讯联系已经建立,以便进一步进行细胞分化和侵入输尿管芽顶部,而不是为了调节体液的水盐和酸碱平衡。三种膜转运体在连接小管的表达比较晚,而同时表达三种膜转运体的连接小管较成年的连接小管短,提示连接小管膜转运体的功能是随着发生发育中小管长度的增加而发挥其重要性的。