微生物细胞内积累的油脂是合成生物柴油与生物航煤的重要原料,油脂酵母以木质纤维素为原料进行油脂发酵为油脂生产提供了一条重要路径。皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)是一种典型的油脂酵母,具有优异的木质纤维素体系适应性。本实验室利用高含油率酵母菌株的细胞密度更低的简单原理,在木质纤维素水解液中对T cutaneum ACCC 20271进行了基于离心筛选的长期适应性进化,通过逐步增加离心力筛选到了油脂生产能力显著增强的突变菌株TTcutaneum MS28,其油脂产量较原始菌株提高了2.41倍。另外,通过降低发酵液体系的粘度与密度以极尽离心筛选强度,获得了油脂产量进一步提升的突变菌株TTcutaneum WL97。两株高产油脂酵母菌株与原始菌株相比,其细胞含油率大幅提高,可更快地利用木质纤维素体系中全部单糖进行油脂发酵,同时细胞壁显著变薄、细胞体积增大。本研究主要利用qRT-PCR方法,对产生这些变化的分子生物学机制进行解析。研究发现,高产油脂酵母细胞内与油脂生产所需前体物质(乙酰-CoA、NADPH)以及中间产物(脂肪酸)合成相关的部分基因发生了几十倍的上调表达差异,同时检测发现其细胞内乙酰-CoA与NADPH含量较原始菌株明显提高,研究表明油脂合成前体物质供给的增多可能是高产菌株油脂合成能力增强的直接原因。与糖酵解以及木质纤维素来源各单糖(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖)代谢路径相关的基因中,多个关键基因的表达水平与原始菌株相比差异上调十分显著,这对多种单糖的快速利用起到了关键作用并为油脂合成提供了更为充足的碳源。高产菌株与细胞壁葡聚糖、几丁质合成分解相关的部分基因发生了非常显著的上调表达差异,测定细胞壁组分发现,细胞壁中葡聚糖、甘露聚糖含量显著下降,几丁质含量变化较小。酵母细胞壁成分的改变可影响细胞壁的结构与功能进而影响酵母的细胞形态,为油脂积累提供更大空间,使高产菌株的油脂生产过程更具优势。本研究首次尝试为TTcutaneum构建有效的遗传操作系统。将潮霉素抗性基因HYR作为表达框的目的基因构建单拷贝整合型质粒pUC19-ΔECH1::HYR,利用电转化方法将该质粒转化至T cutaneum MS28中,筛选获得了HYR基因在基因组ECH1位点发生替换整合的工程菌株T cutaneuT.MS28 ΔECH1::HYR。以工程菌株为研究对象,继续尝试在HYR位点替换整合绿色荧光蛋白基因GFP,获得了潮霉素抗性消失并可释放绿色荧光的工程菌株TTcutaneum MS28Δ HYR::GFP。然而,在后续培养过程中工程菌株发生了目的基因丢失的现象,优化遗传操作系统构建过程的诸多策略均未能解决这一问题。综上所述,本研究从分子生物学角度对超离心筛选得到的T.cutaneum高产菌株与原始菌株的油脂生产相关机制进行解析,为今后更好地对T.cutaneum进行改造和应用打下了重要基础。研究首次尝试构建T.cutaneum遗传操作系统,实现了外源基因在TT cutaneum中的表达,进一步完善后可作为今后分子生物学改造的重要工具。