分子印迹固相萃取结合UHPLC-MS测定复杂样品中烟酰胺单核苷酸的方法研究

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烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide,NMN)是人体内一种内源性物质,是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的五个前体之一,也是具有更好的药代动力学和药理学性质的前体,它参与细胞内NAD的合成,人体的衰老过程伴随着体内NAD含量的减少,大量研究表明体内NAD水平的降低会导致一些与年龄相关的退行性疾病和代谢性疾病的发生,通过服用NMN可以有效的提高体内NAD的含量从而预防和治疗一些与NAD水平降低相关的疾病。因此,近年来NMN成为医学、保健领域的研究热点。由于NMN是生物体内的内源性物质,有关NMN的分析检测不可避免的会遇到两个关键问题,一是如何消除样品的基质效应或降低基质效应对分析准确性的影响,二是在消除基质效应的同时实现对低含量样品的分析。本研究将分子印迹固相萃取技术和UHPLC-MS检测技术联用,实现对复杂样品中NMN的检测,为NMN的医学研究、保健食品的开发提供了理论指导和技术支撑。主要的研究结果如下:(1)以NMN为模板分子、α-甲基丙烯酸为功能单体,采用沉淀聚合法制备烟酰胺单核苷酸分子印迹聚合物微球,该微球对NMN有很好的特异性吸附能力,其等温吸附过程更符合Freundlich模型,印迹位点具有不均匀性;动态吸附过程更符合准二级动力学方程,属于化学吸附。此外,选择性吸附实验结果表明,其分离因子可达15.68,相对分离因子可达2.83,对NMN有着较强的特异性吸附能力,该分子印迹聚合物用于固相萃取西兰花提取液中的NMN时,展现了较高的应用性能。(2)以硅胶为载体,逐步对硅胶表面进行改性处理,然后将功能单体α-甲基丙烯酸接枝到改性硅胶表面,采用表面分子印迹法制备烟酰胺单核苷酸表面分子印迹聚合物,该聚合物对NMN有着良好的特异性吸附效果,印迹因子可达2.06,其等温吸附过程更符合Freundlich模型,具有两类结合位点;动态吸附过程更符合准二级动力学方程,属于化学吸附过程。此外,选择性吸附实验结果表明,其分离因子可达25.52,相对分离因子可达1.70,对NMN有着较强的特异性吸附能力,该表面分子印迹材料不仅选择性好、热稳定性好,而且重复使用性能较好。(3)采用已制备的烟酰胺单核苷酸表面分子印迹聚合物作为固相萃取的填料制备烟酰胺单核苷酸分子印迹固相萃取(Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction,MISPE)柱,回收率可达93.32%,且在实际样品的固相萃取研究中表现出优异的实际应用效能;所建立的MISPE-UHPLC-MS方法在0.25~80μg/m L浓度范围内线性相关性很好(R~2>0.99),方法的检测限可达0.85 ng/m L,且该方法可以有效的消除UHPLC-MS检测过程中的基质效应,其基质效应的范围从43.19%~130.87%改善到89.72%~112.39%,而且线性相关性也得到了提高,其线性相关系数R~2从0.9469提高到了0.9921,大大提高了分析结果的灵敏度和准确性;在消除基质效应的同时该MISPE-UHPLC-MS还可以实现对西兰花中痕量NMN的定量分析,测得西兰花样品中NMN的含量为50.5μg/100g。这不仅对NMN分子印迹聚合物的制备优化和应用具有参考和指导意义,而且也为NMN的医学研究、保健食品的开发提供了理论指导和技术支撑,具有非常重要的研究意义和实用价值。
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