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目的: WNK激酶是近年来新发现的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的成员, WNK1基因突变会导致一种人类常染色体显性遗传的新型家族性高血压疾病,称为假性醛固酮减少症Ⅱ型(pseudohypoaldosteronism typeⅡ, PHAⅡ)。机体血压平衡与肾脏水钠代谢相关,已发现WNK1激酶在肾脏钠离子的重吸收中起着重要的调控作用,然而WNK1是否调节肾脏水的转运完全未知。本研究利用WNK1(1-491)肾脏特异性过表达的转基因小鼠探索WNK1激酶对肾脏水通道蛋白的调控作用。 方法: 1、设计并构建WNK1(1-491)肾脏特异性过表达的转基因小鼠模型。 2、利用无创血压计测量小鼠血压,用小鼠代谢笼测定小鼠饮水量、尿量,利用冰点渗透压仪检测小鼠血尿渗透压,用酶联免疫法检测小鼠血浆AVP浓度。 3、通过分子生物学技术如实时荧光定量PCR、免疫印迹、组织免疫荧光等分别在mRNA、蛋白水平上分析肾脏水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP3、AQP4的表达情况。 4、设计脱水和灌水实验,观察野生型和转基因小鼠的血压、尿量、血尿渗透压以及血浆AVP水平变化。 5、检测脱水和灌水前后野生型和转基因小鼠的肾脏水通道蛋白AQP1、AQP2、AQP3、AQP4的mRNA水平和蛋白水平的表达情况。 6、设计dDAVP注射实验,检测野生型小鼠注射前后WNK1激酶和水通道蛋白的mRNA水平和蛋白水平的表达情况 结果: 1、WNK1(1-491)肾脏特异性过表达的转基因小鼠模型构建成功。 2、在正常情况下,与野生型小鼠相比,转基因小鼠饮水量、尿量显著下降,尿渗透压明显升高,血渗透压下降,血浆AVP水平显著升高。 3、在正常情况下,与野生型小鼠相比,转基因小鼠肾脏水通道蛋白AQP2蛋白表达量显著升高而AQP1、AQP3、AQP4无明显差异。 4、相较于正常情况下,脱水后野生型和转基因小鼠尿量都下降、血尿渗透压都上升,但转基因小鼠变化不如野生型小鼠明显。此外野生型小鼠血AVP水平明显升高,而转基因小鼠血AVP浓度变化无统计学意义。 5、相较于正常情况下,脱水后野生型小鼠AQP1、AQP2、AQP4蛋白表达量明显升高,而AQP3无明显变化。而转基因小鼠AQP4蛋白表达量明显升高,而AQP1、AQP2、AQP3无明显变化,即脱水消除了正常情况下野生型和转基因小鼠中AQP2的表达差异。 6、相较于正常情况下,灌水后两组小鼠尿量都上升,尿渗透压都下降,血渗透压都下降,血AVP均保持不变。但转基因小鼠尿量上升不如野生型小鼠明显,而血渗透压下降更多。 7、相较于正常情况下,灌水后两组小鼠肾脏AQP2、AQP4蛋白都下降,AQP3蛋白表达量明显上升,而AQP1含量保持不变,且灌水后野生型和转基因小鼠间的AQP2差异缩小。 8、注射dDAVP后,野生型小鼠肾脏中WNK1和AQP2的表达量均显著升高。 结论: 我们的研究结果表明WNK1(1-491)过表达的转基因小鼠体内存在水平衡失调,这可能与转基因小鼠肾脏AQP2的表达、血浆AVP水平以及WNK1激酶蛋白含量升高相关,暗示着WNK1激酶在体内可能存在着对AQP2的调控作用,这种作用在一定程度上与AVP相关,这对进一步探索WNK激酶的作用、AQP2的调控机制以及高血压的临床治疗有着重要的指导意义。