【背景】牙种植修复技术已广泛应用于恢复患者牙列缺损或缺失,成为一种常规的修复手段,但由于种植体所采用的纯钛材料生物活性欠佳,临床中仍存在因骨结合不良而失败的病例。因此,如何赋予钛种植体表面更理想的生物活性是当今研究的热点。实际上,天然骨组织具有多级微纳米梯度结构并含有硅、锶、锌等重要微量元素,从仿生学角度来看,若能在钛表面同时构建出与骨组织更为接近的物理形貌和化学组分,或将实现更好的生物活性。课题组前期采用酸蚀和阳极氧化技术在钛表面成功制备出二氧化钛纳米管（TNT）仿生微纳结构,管径在30 nm～100 nm可调,展现出一定的促成骨能力,但仍与骨组织的物理形貌和元素构成存在差异,值得进一步探索。近年来,介孔硅纳米薄膜因其极高的比表面积、易于修饰的内外表面,无毒可降解等特点受到了越来越多的关注。其中我们发现,采用阳离子表面活性剂作为模板所制备的介孔硅薄膜,其介孔孔径通常小于10 nm,这有望填补材料表面形貌在该纳米尺度范围内的空白。此外,硅元素也是骨形成过程中重要的化学组分。结合以上两点,在课题组原先构筑的TNT表面,进一步制备出更小孔径介孔硅结构,可能会实现与骨组织结构更为接近的纳米梯度结构和富含硅元素的化学组分双重仿生效果。介孔硅薄膜根据内部孔道取向不同,可分为水平介孔硅薄膜（PMSTF）和垂直介孔硅薄膜（VMSTF）。前者制备工艺简单,研究更加广泛,但这类薄膜存在两大局限:（1）水平走行的内部孔道将导致介孔结构更多暴露在薄膜侧面而非表面。（2）目前钛基底表面往往会预先进行微纳形貌加工,但这类薄膜厚度较厚,通常会覆盖整个基底表面,可能会阻碍基底活性形貌发挥作用。与PMSTF不同的是,VMSTF内部的孔道多为垂直走行,薄膜表面可见清晰完整的介孔结构,而且这类薄膜厚度通常为纳米级。基于此,VMSTF可能更适用于钛表面仿生纳米梯度结构的构建。目前,油水两相法因具有工艺简单,条件温和等优点,已成为制备VMSTF较为常用的手段。但大多数研究主要是在平整的非金属基底表面进行（例如玻璃、硅片等）,而在具有纳米阵列结构的TNT表面是否可以沉积薄层的VMSTF,并构成复合梯度纳米形貌（VMSTF@TNT）是本课题的难点和关键。为此,本研究在解决介孔硅/钛纳米管复合梯度纳米形貌的构建这一关键问题的基础上,对这一仿生结构进行了深入的生物学评价,为该结构的进一步临床应用奠定理论基础。【目的】探明油水两相法在纯钛表面制备VMSTF@TNT梯度纳米形貌的可行性;分析材料合成的影响因素及自身理化性能;观察材料基本的降解、生物相容及载药性能;评价成骨细胞在材料表面的基本生物学反应;分析人血浆蛋白在材料表面的吸附行为,内在机理及其对止血能力的影响。【方法】第一部分:介孔硅/钛纳米管复合梯度纳米形貌的构建及基本性能研究1.采用氢氟酸酸蚀,阳极氧化和油水两相法制备VMSTF@TNT,其中油水两相体系是由硅源“正硅酸乙酯”,模板剂“十六烷基三甲基溴化铵”,催化剂“三乙胺”和油分子“环己烷”所构成,反应完成后采用煅烧法去除模板剂获得最终试样;采用场发射扫描电镜,场发射透射电镜观察试样表面形貌,并采用Image J软件测定孔径分布;采用红外光谱,能谱仪和固态核磁硅谱检测试样表面元素构成、分布及硅羟基相对含量;采用水接触角测定和XRD检测试样表面亲水性及钛基底晶相改变。2.采用扫描电镜、原子力显微镜观察不同反应时间（≤24 h）,不同试剂用量（TEOS含量、油分子种类）,不同尺寸TNT（30 nm～100 nm）,不同性质基底（钛纳米网、羟基磷灰石颗粒、羟基化钛片）对VMSTF合成及形貌的影响。3.使用磷酸盐缓冲液在37℃条件下进行体外模拟浸泡实验。分别采用扫描电镜、电感耦合等离子体发射光谱仪观察不同时间点下材料表面形貌的降解变化和硅离子释放行为。4.将成骨细胞系MC3T3-E1在材料表面接种一定时间后,使用荧光染色、扫描电镜和CCK-8实验观测细胞粘附、形态和活力;进一步地,通过在原合成体系增加硅烷偶联剂（BTSE）,制备有机-无机杂化介孔硅薄膜,观察其降解行为和表面细胞活力。5.利用经典的小分子促成骨药物——地塞米松（DEX）作为模型分子,采用真空吸附法进行药物加载试验。通过红外光谱、扫描电镜对DEX进行定性分析;通过酶标仪测定DEX在262 nm处的吸光度,定量比较TNT,PMSTF和VMSTF@TNT三者的加载量和释放速率。第二部分:介孔硅/钛纳米管复合梯度纳米形貌的生物学评价1.以100 nm大管径TNT为基底,通过改变介孔硅沉积反应时间（2 h,4 h,24h）,制备出不同介孔硅含量的复合结构,分别记为2H-VMSTF,4H-VMSTF,24H-VMSTF。通过不添加模板剂,在同样反应24 h后制备出无介孔结构的氧化硅薄膜,记为24H-STF。利用以上4组来探索介孔硅薄膜的物理（介孔形貌）、化学（硅含量）双重促成骨效果。2.将成骨细胞系MC3T3-E1分别培养在不同试样表面,采用q PCR检测成骨相关基因表达水平;使用试剂盒进行碱性磷酸酶染色,并测定其活性;通过茜素红染液检测细胞外基质矿化水平。3.将TNT、PMSTF和VMSTF@TNT浸泡在健康人血浆中2 h后取出,采用5%SDS溶液洗脱后进行Label-free蛋白组学分析。对所筛选的蛋白按等电点、分子量和生理功能进行分类。4.将三组试样分别浸泡在去离子水和生理盐溶液中,观察材料表面电位和蛋白吸附速率的变化。5.将人全血血浆和富血小板血浆涂布于三组试样表面,通过全血凝血试验、凝血指数测定、血细胞和血小板粘附观察,评价试样止血能力。【结果】第一部分:介孔硅/钛纳米管复合梯度纳米形貌的构建及基本性能研究1.在TNT表面采用油水两相法成功制备出VMSTF。该薄膜不仅具有直通外界的介孔孔洞（～3 nm）,而且可沿TNT表面均匀、连续沉积,构成了复合梯度纳米形貌;材料表面硅、氧、钛呈同心圆状规律性分布,硅羟基含量约占5.56 wt%,水接触角约为7°,钛基底在材料制备煅烧同期转变为更具生物活性的锐钛矿、金红石混合晶相。2.VMSTF的沉积呈时间依赖性。反应时间12 h以内时,主要表现为管内沉积,表面粗糙度未见明显改变。当反应时间超过12 h,主要表现为管外沉积,表面粗糙度也随之增长1倍;改变硅源TEOS用量,更换有机溶剂种类只会影响薄膜合成,未发现对介孔精细结构产生影响,孔径稳定在2 nm～3 nm;VMSTF在不同30 nm～100nm管径的TNT表面均可沉积,介孔形貌未见明显差异;VMSTF在羟基化钛片、钛纳米网和羟基磷灰石纳米颗粒表面均可沉积,在普通光滑钛片表面无法沉积。3.在模拟生理环境中,薄膜的介孔结构可维持2 h,但24 h后降解完全,表面恢复为纳米管阵列结构。硅的累积释放量为10 ppm。4.MC3T3-E1细胞在VMSTF@TNT材料表面接种2 h后,细胞粘附数量显著升高,细胞伸展更为充分,可见大量伪足。接种1 d和3 d后细胞活力也均显著高于单纯纳米管组。5.通过在体系内加入硅烷偶联剂BTSE,成功合成出了有机-无机杂化介孔硅薄膜,其形貌与无机介孔硅薄膜VMSTF类似,体外浸泡21 d仍不发生降解。随着BTSE含量的增加,其水接触角从35°增加至60°,但细胞活性随之发生抑制。6.DEX加载完毕后,TNT、PMSTF和VMSTF@TNT表面均可见部分物质沉积,红外光谱可探测到1620 cm-1,1662 cm-1,1702 cm-1三处特征峰,证明了DEX的加载成功。其中VMSTF@TNT表面加载量为1.73 mg/cm~2,而TNT和PMSTF分别为0.76 mg/cm~2和0.71 mg/cm~2;三组试样均表现为DEX突释,在小时尺度内释放量均达到80%,但VMSTF@TNT表面DEX释放相对较缓（4 h＞2 h）。第二部分:介孔硅/钛纳米管复合梯度纳米形貌的生物学评价1.2H-VMSTF、4H-VMSTF、24H-VMSTF、24H-STF均制备成功,其中24H-STF表面未见介孔结构,为单纯二氧化硅层。2.介孔硅含量增加可提升材料促成骨效果,但在成骨诱导10 d后,低硅含量的4H-VMSTF与高硅含量的24H-VMSTF不存在显著差异。在相同沉积时间下,无介孔形貌的24H-STF,其成骨效果始终不及含有介孔形貌的24H-VMSTF,仅与低介孔硅含量的2H-VMSTF相当。3.TNT、PMSTF和VMSTF@TNT具有独特的蛋白吸附谱,大多数蛋白并非人血浆中高丰度蛋白;其中,PMSTF和VMSTF@TNT更倾向于吸附酸性蛋白（p I＜7）,其中以人血清白蛋白（HSA）最为显著;由于这些酸性蛋白的分子量大多分布于60～80KDa和100～200 KDa,以及凝血、补体、脂蛋白等功能类别中,进而导致PMSTF和VMSTF@TNT表面血浆蛋白也呈现相同的富集结果。4.由于介孔硅的掺入,PMSTF和VMSTF@TNT的电负性增强,当与同样带负电荷的HSA接触时,两者吸附量均不及TNT;但当试样处于HBSS中时,HSA吸附行为被彻底逆转,PMSTF和VMSTF@TNT的吸附量均高于TNT,且后者提高更为明显。进一步研究发现,PMSTF和VMSTF@TNT可以通过Si-OH基团吸附HBSS中的Na+、Ca2+离子,导致负电性减弱,缩小了与HSA负电性差距,从而一定程度上促进了HSA吸附。5.PMSTF和VMSTF@TNT可促进红细胞聚集和血小板活化,表面的血凝块更加稳定,在体外展现出良好的止血能力。【结论】本课题采用阳极氧化和油水两相法成功在钛纳米管表面原位沉积出垂直介孔硅薄膜,其直径3 nm的介孔孔洞均匀的沉积在直径约100 nm的纳米管表面,构成了大孔-介孔梯度纳米形貌。该形貌具有高速降解性（＜24 h）、较强的亲水性（7°）、适宜的硅释放量（10 ppm）和良好的药物负载能力（提高1倍以上）;此外,该形貌不仅提升了成骨细胞的粘附、增殖和分化能力,体现了良好的成骨活性,还可以促进人血浆蛋白,尤其是凝血相关蛋白的富集,从而兼具了止血活性。本研究工作为生物材料表面涂层设计提供了新的研发策略,显示了介孔材料在组织工程中的广阔应用前景。