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目的:白花地胆草(Elephantopus mollis)是我国的传统中药,具有多种药理活性。本课题组的前期工作中,从白花地胆草中分离纯化得到多个倍半萜内酯类化合物(SLs)。其中,EM23对人慢性髓性白血病细胞系K562和人急性髓性白血病细胞系HL-60显示出较好的增殖抑制活性,但是其胞内的分子靶标和潜在的作用机制仍然未知。本研究的目的是探究EM23的体外抗白血病活性和作用机制,为EM23进一步开发为抗髓性白血病候选药物提供科学依据。方法:1.EM23抑制细胞增殖和细胞周期进程:首先通过CCK-8和MTT实验检测EM23对人髓性白血病细胞和正常哺乳细胞的增殖抑制作用;之后利用PI染色流式细胞实验分析EM23对K562和HL-60细胞周期分布的影响。2.EM23诱导细胞凋亡:首先通过Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞实验检测细胞凋亡的发生;之后TUNEL-DAPI双染激光共聚焦实验观察EM23作用K562和HL-60细胞后DNA片段化是否增加;western blotting实验检测EM23作用细胞后凋亡相关caspase蛋白表达水平的变化;线粒体膜电位下降是细胞凋亡的早期事件,我们采用荧光探针JC-1检测EM23作用后线粒体膜电位的变化。3.EM23干扰胞内的氧化还原平衡:首先采用荧光探针DCFH-DA检测胞内活性氧(ROS)水平的变化;然后检测EM23对胞内重要的抗氧化系统Trx系统的影响,western blotting实验检测EM23作用后胞内Trx R和Trx的蛋白表达变化,实时定量PCR(QT-PCR)检测胞内m RNA表达水平的变化。4.EM23激活ASK1和p38/JNK/ERK MAPK:western blotting实验检测EM23作用后ASK1和p38、JNK、ERK三个MAPK蛋白是否被活化;CCK-8实验检测ERK抑制剂FR180204对EM23介导的增殖抑制活性的影响。5.EM23对TNF-α介导的NF-κB活化的抑制作用:免疫荧光和western blotting实验检测EM23对TNF-α引起的p65核转位的影响;在细胞质中,IκBα是NF-κB的负调节蛋白,TNF-α作用K562和HL-60细胞后导致IκBα降解,我们通过western blotting实验检测EM23对TNF-α介导的IκBα降解的影响;EM23和TNF-α联合使用的肿瘤细胞增殖抑制活性通过CCK-8实验检测。结果:本研究显示,来自于白花地胆草的天然倍半萜内酯类化合物EM23通过诱导细胞凋亡来抑制人慢性和急性髓性白血病细胞K562和HL-60的增殖。磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的外翻、细胞凋亡形态的出现、caspase和PARP蛋白的激活都可以证明EM23作用细胞后细胞凋亡的发生。MMP下降说明EM23诱导的凋亡属于线粒体介导的凋亡途径。机制研究的结果显示EM23作用细胞后可以显著升高胞内的ROS水平,而ROS清除剂NAC几乎可以完全逆转EM23引起的凋亡作用,提示EM23是以一种ROS依赖性的方式来诱导细胞凋亡。在EM23作用后的K562和HL-60细胞中,硫氧还蛋白(Trx)和硫氧还蛋白还原酶(Trx R)的m RNA转录和蛋白表达水平被显著下调。EM23升高胞内ROS并抑制Trx系统导致下游ASK1和MAPK通路的活化,而该活化作用同样可以被NAC逆转。此外,EM23抑制由TNF-α介导的p65入核和IκBα的降解结论:本研究表明,EM23通过线粒体介导的凋亡途径来抑制人髓性白血病细胞K562和HL-60细胞的增殖。EM23可能通过对Trx抗氧化系统的抑制导致胞内ROS的积累,随后激活了Trx系统调控的下游信号通路,包括ASK1,p38,JNK和ERK等,来发挥其诱导细胞凋亡的活性。此外,EM23还阻断了TNF-α/NF-κB轴信号,提示EM23可能同时抑制了NF-κB介导的抗凋亡途径来发挥其抗白血病活性。本研究第一次较为综合地研究了EM23的体外抗白血病活性和作用机制,为EM23进一步开发为抗髓性白血病候选药物提供科学依据,也为白花地胆草倍半萜内酯类化合物的抗白血病作用机制提供了新的见解。