肝纤维化是一切慢性肝病共同的病理学基础,当肝细胞发生坏死,或受到炎症刺激时,肝内纤维结缔组织会大量增生,这一病理过程中较轻而可逆者称为肝纤维化,重者出现假小叶及结节形成则称为肝硬化。其间涉及多种细胞的活化增殖或变性、多种细胞因子功能的表现、大量细胞外基质(ECM)的分泌及细胞凋亡等复杂因素的病理生理过程。各种因素之间相互影响、相互交错,形成肝纤维化的动态变化网络。其中ECM成分合成和降解的失衡是导致肝组织重构、发生纤维化的直接原因,细胞因子及多肽类生长因子等调控因子是启动、调节肝纤维化发展的重要因素,细胞凋亡则是肝纤维化逆转的重要途径。肝星状细胞(HSC)是肝脏中的一种非实质细胞,位于Disse间隙内,形态不规则,胞体呈卵圆形,胞质富含维生素A脂滴,核周部分包埋在邻近肝细胞的隐窝内,其对肝脏的ECM产生、生长因子合成、基质重建以及窦孔改变等生理过程均可产生影响。研究发现,多种细胞、细胞因子、ECM和非肽类介质(如乙醇、活性氧等)参与HSC的激活和肝纤维化。当肝脏受到物理化学及生物因素刺激时,HSC失去类维生素A,旺盛增殖,合成和分泌大量的ECM成分,如胶原、蛋白多糖和糖蛋白等,细胞的结构也由星状转变为具有发达的粗面内质网和高尔基复合体的成纤维细胞样细胞或肌成纤维细胞(MFB)。桃仁性平,味甘、苦,有小毒,归心、肝、大肠经,为常用的活血化瘀中药,具有活血祛瘀,润肠通便之效,常用于各种肝病血瘀相关证型的复方治疗中。既往研究发现,桃仁提取物可通过增加肝血流量,促进I、Ⅲ和Ⅳ型胶原的降解,阻止Ⅰ、Ⅱ型前胶原的沉积,保护脂质过氧化损伤作用等预防肝纤维化的形成。苦杏仁苷为桃仁提取物最主要、最常见的药理成分,国内、外目前对其抗肝纤维化的药理研究较少,其开发和应用空间有待进一步挖掘。研究目的研究苦杏仁苷对HSC的活化增殖及相关细胞因子网络的作用,以期揭示苦杏仁苷抗纤维化的分子机制。研究方法1苦杏仁苷对HSC增殖及分泌ECM的影响1.1绘制HSC-T6的自然生长曲线将冷冻的HSC-T6细胞株复苏,恒温箱培养至细胞呈单层致密状,胰蛋白酶消化后传代,待细胞生长稳定后,MTT法绘制HSC-T6的自然生长曲线。1.2苦杏仁苷对HSC-T6增殖的影响细胞培养同前,加入低、中、高各剂量级苦杏仁苷,MTT法检测细胞生长情况。1.3苦杏仁苷对ECM合成的影响用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA,酶联免疫法(ELISA)和放射免疫法(RIA)分别检测Ⅰ型胶原和透明质酸含量。2苦杏仁苷对相关细胞因子网络的调节作用2.1苦杏仁苷对转化生长因子(TGF)-β1的影响苦杏仁苷对HSC-T6细胞TGF-β1m RNA的影响用RT-PCR检测,对HSC-T6细胞TGF-β1蛋白的影响用Western Blot法检测,对TGF-β1受体的影响采用流式细胞技术检测。苦杏仁苷对TGF-β1的下游效应递质结缔组织生长因子(CTGF)m RNA的影响用RT-PCR检测。2.2苦杏仁苷对血小板源性生长因子(PDGF)的影响苦杏仁苷对HSC-T6细胞PDGFm RNA的影响用RT-PCR检测,对HSC-T6细胞PDGF蛋白的影响用Western Blot法检测,对PDGF受体的影响采用流式细胞技术检测。苦杏仁苷对胰岛素样生长因子(IGF)m RNA的影响用RT-PCR检测。2.3苦杏仁苷对血管紧张素(Ang)Ⅱ刺激HSC活化的抑制作用苦杏仁苷对AngⅡ刺激HSC活化Ca2+效应的抑制作用采用激光扫瞄共焦显微镜(LSCM)检测,对AngⅡ刺激HSC活化TGF-β1m RNA的抑制作用用RT-PCR检测,对AngⅡ刺激HSC活化碱性成纤维生长因子(b FGF)表达的抑制作用用免疫组化法检测。2.4苦杏仁苷对干扰素(IFN)抑制HSC活化的促进作用苦杏仁苷对IFN抑制HSC活化TGF-β1mRNA的促进作用用RT-PCR检测。研究结果1苦杏仁苷对HSC增殖及分泌ECM的影响1.1苦杏仁苷对HSC-T6增殖的影响10-6mmol/L~1mmol/L不同浓度苦杏仁苷作用的OD值比较,差异均无显著性意义(P>0.05)。正常组与各苦杏仁苷组比较,差异也无显著性意义(P>0.05)。在药物作用第5天时,各苦杏仁苷组的细胞生长曲线均未受到抑制,反而出现刺激促进生长增殖的效果,其OD值与正常组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。但在其他时间段(第1天、3天、7天),苦杏仁苷各用药组的细胞生长曲线与正常组相近,其OD值与正常组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。提示苦杏仁苷对HSC-T6的增殖可能未有抑制作用,也没有明显的细胞毒性作用。1.2苦杏仁苷对ECM合成的影响各苦杏仁苷组对Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA均有明显的抑制作用,与正常组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。均以苦杏仁苷中剂量组最为明显,苦杏仁苷高剂量组次之,苦杏仁苷低剂量组再次之。提示苦杏仁苷对HSC-T6细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原m RNA表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用不与剂量成正比。作用72h时,苦杏仁苷各剂量组Ⅰ型胶原分泌与正常组比较,差异均有显著性意义(P<0.05),但苦杏仁苷各组组间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。提示苦杏仁苷作用72h后对Ⅰ型胶原分泌有明显抑制作用,但这一作用也不呈现剂量依赖。正常组透明质酸分泌曲线与苦杏仁苷低剂量组稍有重叠,位置较苦杏仁苷高、中剂量组分泌曲线高,提示苦杏仁苷高、中剂量组均有抑制透明质酸分泌的趋势(P>0.05),但效果并不显著。2苦杏仁苷对相关细胞因子网络的调节作用2.1苦杏仁苷对TGF-β1的影响乙醛组对TGF-βm RNA有一定促进作用,但与正常组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。乙醛组对CTGFm RNA也有明显促进作用,与正常组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。各苦杏仁苷组对TGF-βm RNA、CTGFm RNA则均有非常明显的抑制作用,与乙醛组比较,差异均有显著性意义(P<0.05);各苦杏仁苷组组间比较,TGF-βm RNA差异均有显著性意义(P<0.05),CTGFm RNA苦杏仁苷高、中剂量组与低剂量组比较,差异均有显著性意义(P<0.05),但苦杏仁苷高、中剂量组组间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。提示苦杏仁苷对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-βm RNA及CTGF m RNA均有明显的抑制作用,且这种抑制作用与剂量成正比。乙醛组对TGF-β蛋白表达有明显促进作用,各苦杏仁苷组对TGF-β蛋白表达,无论在24h还是72h,则均有非常明显的抑制作用。24h时以苦杏仁苷高剂量组最为明显,苦杏仁苷中剂量组次之,苦杏仁苷低剂量组再次之;72h时以苦杏仁苷高剂量组最为明显,苦杏仁苷低剂量组次之,苦杏仁苷中剂量组再次之。提示苦杏仁苷对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-β蛋白表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用有可能与剂量成正比。正常组TGF-β1受体表达非常微弱,乙醛组对TGF-β1受体表达有明显促进作用;各苦杏仁苷组对TGF-β1受体表达均有明显的抑制作用,但苦杏仁苷高、中、低剂量组间不存在递进关系。提示乙醛可显著刺激HSC细胞TGF-β1受体表达,苦杏仁苷对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-β1受体表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用可能并不与剂量成正比。2.2苦杏仁苷对PDGF的影响苦杏仁苷高剂量组对PDGFm RNA、IGFm RNA有较明显的抑制作用,与正常组比较,差异有显著性意义(P<0.05),与苦杏仁苷中、低剂量组比较,差异也有显著性意义(P<0.05)。但苦杏仁苷中、低剂量组未表现出抑制作用(P>0.05)。提示苦杏仁苷在高剂量对HSC-T6细胞PDGFm RNA和IGFm RNA有明显的抑制作用,但中、低剂量则无,可能这种抑制作用与剂量有关。各苦杏仁苷组对PDGF蛋白表达,无论在24h、48h还是72h,均有非常明显的抑制作用,各时间点均以苦杏仁苷高剂量组最为明显,苦杏仁苷中剂量组次之,苦杏仁苷低剂量组再次之。提示苦杏仁苷对HSC-T6细胞PDGF蛋白表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用有可能与剂量成正比。正常组、各苦杏仁苷组PDGFR-α和PDGFR-β的表达都极其微弱,且均相差无几。2.3苦杏仁苷对AngⅡ刺激HSC活化的抑制作用LSCM下Ca2+荧光成像的HSC-T6细胞仍可部分表现普通倒置显微镜下的形态学特征,AngⅡ组Ca2+荧光强度非常明显,清晰可见;正常组强度也较明显,稍次于AngⅡ组;苦杏仁苷高剂量组强度也较强,稍次于AngⅡ组和正常组,但区别不甚明显;苦杏仁苷中、低剂量组强度明显减弱,并可见大量Ca2+噬斑出现。Ca2+荧光强度相对值的统计分析也反应上述结果。AngⅡ组对TGF-βm RNA有一定促进作用,但与正常组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。各苦杏仁苷组对TGF-βm RNA则均有明显的抑制作用,与AngⅡ组比较,高、中剂量组差异均有显著性意义(P<0.05),而低剂量组仅有抑制趋势,差异并无显著性意义(P>0.05)。提示AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6细胞TGF-βm RNA作用,但不甚明显;而苦杏仁苷对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞TGF-βm RNA有明显的抑制作用,且这种抑制作用与剂量成正比。AngⅡ组、正常组、各苦杏仁苷组均未见b FGF的阳性表达。2.4苦杏仁苷对干扰素IFN抑制HSC活化的促进作用IFN组对TGF-βm RNA有明显的抑制作用,与正常组比较,差异有显著性意义(P>0.05);而苦杏仁苷各剂量组与正常组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。苦杏仁苷中、低剂量组与IFN组比较,差异有显著性意义(P<0.05);而苦杏仁苷高剂量组与IFN组比较,差异则无显著性意义(P>0.05)。提示IFN确实有强烈的抑制TGF-βm RNA效果;但苦杏仁苷对这一效果不但没有协同促进作用,反而对这一效果可能有一定的抑制作用。结论1苦杏仁苷对HSC增殖及分泌细胞外基质(ECM)的影响苦杏仁苷对HSC-T6的增殖可能未有抑制作用,且在第5天苦杏仁苷反而明显刺激HSC-T6的增殖,考虑可能由于苦杏仁苷对HSC-T6有提前生长曲线而促进凋亡的作用。同时,苦杏仁苷对HSC-T6没有明显的细胞毒性作用。苦杏仁苷对HSC-T6细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用不与剂量成正比;HSC-T6分泌Ⅰ型胶原作用的研究也印证了上述结果;苦杏仁苷对透明质酸分泌的抑制作用可能存在,但不显著。苦杏仁苷对HSC-T6细胞活化后的分泌功能有抑制作用,此可能是其抗肝纤维化的主要机制之一。2苦杏仁苷对相关细胞因子网络的调节作用加入乙醛刺激后的HSC-T6细胞TGF-βmRNA、CTGFmRNA有所增加,表明乙醛可刺激HSC增殖,导致纤维结缔组织增生和降解失去平衡,肝脏ECM异常沉积,是酒精性肝纤维化发生的关键因素。苦杏仁苷对TGF-βm RNA、CTGFm RNA均有非常明显的抑制作用,并且呈现剂量依赖模式;且TGF-β、CTGF具有相关系的变化趋势。苦杏仁苷对TGF-β蛋白及其受体表达均有明显的抑制作用,其中在蛋白表达的抑制作用方面,与对TGF-βm RNA影响一致的呈现一定的剂量依赖模式。在TGF-β受体的抑制作用方面,效果也较为显著,但不存在剂量依赖模式。苦杏仁苷对HSC-T6细胞TGF-β、CTGF细胞因子的序贯抑制作用,是其参与抗肝纤维化细胞因子网络的重要切入点。苦杏仁苷对PDGF、IGFm RNA均有明显的抑制作用,这种抑制作用可能与剂量有相关性,且PDGF、IGF具有相关系的变化趋势。苦杏仁苷组对PDGF蛋白表达的明显抑制作用也呈现出一定的剂量依赖的模式,与RT-PCR研究结果一致。但在PDGF受体的抑制作用方面,则未见明显效果。苦杏仁苷也可通过影响PDGF及IGF来参与抗肝纤维化细胞因子网络的调控。AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6细胞活化Ca的效应,但不甚明显。这可能与AngⅡ刺激作用有限有关,也可能是由于其他因素导致HSC生物转化功能下降的原因。苦杏仁苷对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞活化Ca2+效应有明显的抑制作用,可能是由于苦杏仁苷可以阻断或抑制HSC的AngⅡ信号转导通路,从而抑制了HSC内Ca2+升高的作用,并因此抑制了HSC的活化与增殖。AngⅡ还可能存在一定的刺激HSC-T6细胞TGF-βm RNA表达作用,但不甚明显,未及前面实验中的乙醛刺激。同样,AngⅡ也不能有效刺激b FGF蛋白的表达,也进一步说明了这一结果。而苦杏仁苷对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞TGF-βm RNA表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用与剂量成正比,再次证明了前文的研究结果。在肝纤维化发生发展的过程中,常伴有肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的异常激活,对病情发展起着重要的促进作用,故AngⅡ也是肝纤维化细胞因子网络的重要调控因子。而本研究证明,苦杏仁苷也可通过这一环节来起到抗肝纤维化的作用。IFN-γ对TGF-βm RNA有明显的抑制作用,但苦杏仁苷对IFN-γ的抗肝纤维化效果不但没有协同促进作用,反而可能有一定的抑制作用。