柑橘是我国南方重要的水果之一,其产业发展对促进地区经济具有重要作用。近年来柑橘产业虽然取得了巨大的发展,但常受到干旱、盐及低温等各种非生物逆境胁迫,因此,如何高效培育柑橘抗逆新品种成为当前育种学家亟需解决的课题。柑橘育种方法主要有常规育种、芽变选种和基因工程等,但常规育种存在雌雄性败育,珠心胚干扰,遗传高度杂合等问题,而芽变选种培育周期过长,随着生物技术水平的提高,特别是基因工程的发展,为柑橘的育种提供了一条新的途径。抗逆机理解析及重要基因克隆是基因工程的前题,是柑橘分子育种的关键。但目前柑橘抗性基因的克隆较少,鉴定出功能的基因更少,这严重阻碍了柑橘抗逆分子育种的步伐。从前人的研究得知,转录因子ABF、bHLH、ICE1及蛋白激酶MAPK在植物抗非生物胁迫中起重要作用,因此本研究从枳中分离、克隆得到ABF,MAPK、bHLH及ICE1基因,并对他们进行抗逆功能鉴定。其目的是为了深入解析抗性基因的分子机理,获得拥有自主知识产权的柑橘抗性基因资源。主要研究结果如下：1.采用电子克隆从枳中克隆得到ABA响应的转录因子(PtrABF),它包含1347bp的开放阅读框,编码448个氨基酸,预测蛋白质分子量为48kD,等电点9.66。多序列比对显示PtrABF与其它物种的ABF有很高的同源性。PtrABF定位于细胞核,有转录激活活性,能与ABRE元件结合,表明它是一个转录因子。表达模式分析显示它能被脱水、低温及ABA诱导。烟草中超表达PtrABF,表明转基因植株比未转化植株的抗脱水和抗旱能力显著提高。脱水和干旱条件下转基因植株比未转化植株活性氧积累低,三种抗氧化酶的活性及基因表达量均较高。另外,在干旱处理前后,9个逆境相关基因的表达量在转基因烟草中都比非转基因植株高。所有结果显示,PtrABF转基因植株抗旱能力显著提高。2.利用电子克隆及RACE技术从枳中分离克隆出PtrMAPK,该基因包含1128bp开放性阅读框,编码375个氨基酸,蛋白质分子量为43kD,等电点为5.51。生物信息学分析表明PtrMAPK包括11个保守的激酶结构域和一个磷酸化位点,亚细胞定位表明它定位于细胞核。PtrMAPK受干旱及低温的诱导但不受盐的诱导。与未转化植株相比,PtrMAPK转基因烟草超表达植株的抗脱水和抗旱能力明显提高,进一步研究表明,抗性增强与抗氧化酶活性提高相关。此外,转基因烟草在干旱处理前后,相关逆境响应基因的表达量明显上升。研究结果表明,PtrMAPK转基因植株具有较强的抗旱能力。3.从枳中克隆出PtrbHLH基因,该基因全长1921bp,它包括1464bp的开放性阅读框,编码487个氨基酸,等电点为5.30,分子量预测为53.6kD。多序列比对表明其编码的氨基酸序列中含有保守的ZIP结构域、bHLH结构域、C末段区域及SUMO结合结构域。PtrbHLH定位于细胞核,具有转录激活活性。ExPASy网站中的Signal P软件预测表明PtrbHLH氨基酸序列中具有一个核定位信号(NLS)及一个bHLH DNA结合结构域；SMART预测PtrbHLH氨基酸序列中含有一个转录激活结构域。PtrbHLH受低温、脱水及盐的诱导。超表达PtrbHLH的转基因柠檬和烟草植株的抗寒能力提高,但其RNAi-PtrbHLH转入枳使其抗性下降。采用Affymetrix芯片杂交分析表明,PtrbHLH的转基因柠檬中有108个基因上调,其中包括与H202清除有关的POD基因。进一步研究表明,超表达PtrbHLH的转基因植株(烟草和柠檬)中POD活性强,在氧化胁迫下抗性也增强。但采用POD抑制剂处理转基因烟草后,H202清除能力及抗寒性减弱。这些结果表明,PtrbHLH是通过调控POD来增强植物的抗寒能力。4.采用电子克隆和RACE等手段从枳中克隆出PtrICE1基因,该基因包含一个1680bp的开放阅读框,编码559个氨基酸,蛋白预测的分子量为61kD,等电点为5.27。生物信息学分析显示PtrICE1氨基酸序列与其它植物氨基酸同源性较高,有两个保守的bHLH结构域和一个SUMO结合结构域。PtrICE1定位于细胞核,有很强的转录激活活性以及能与顺式作用元件MYC结合,这些都说明它是一个转录因子。在低温、脱水、盐及脱落酸诱导下PtrICE1的转录水平都有很大的提高,表明PtrICE1能受这些非生物逆境的诱导。PtrICE1在CaM35S启动子下在烟草中的超表达分析显示,它的抗寒能力得到很大的提高。