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目的：
头颈癌是指一组发生在包括口腔、口咽、下咽、喉等部位的恶性肿瘤。小分子靶向药日益成为重要的辅助治疗手段。它能够特异性的识别并杀伤肿瘤细胞，有潜在的应用前景。在过去的十几年中，蛋白酶体抑制剂在血液系统恶性肿瘤治疗中的应用已大大扩展，2003年硼替佐米（万珂）被FDA批准用于复发性多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤治疗，至今它已在骨髓瘤和小儿/成人急性白血病患者的疗效上取得重大进步，但是在头颈肿瘤等实体瘤的治疗上却进展缓慢。导致这一结果的原因很多，实体肿瘤细胞内固有的耐药机制可能是其最主要的原因。
一般来说，细胞内的某些蛋白质的突变，过表达或者持续性激活都可能会促使耐药产生。这些蛋白质可以通过激活或者抑制某些细胞通路，使肿瘤细胞在药物压力下不发生凋亡，从而降低对药物的敏感性。肿瘤测序研究显示约有20％-25％的头颈鳞状细胞癌出现TP63的扩增，ΔNp63亚型过表达更为常见，超过80％的头颈鳞状细胞癌病例中ΔNp63α亚型上调。ΔN亚型是p63的显性失活形式，可以通过抑制细胞周期调控蛋白p21的转录，促进肿瘤细胞的增殖。在头颈鳞癌细胞中，高表达的ΔNp63α能保护细胞、避免凋亡，可以被视为预后的一个标志物。课题组前期通过药物敏感性筛选平台的研究发现，不同的头颈鳞癌细胞株对硼替佐米敏感性有明显的差异，并发现个别相对敏感的头颈鳞癌细胞株的ΔNp63α的表达量较少。根据这个发现，推测ΔNp63α可能是头颈鳞癌细胞对硼替佐米发生耐药的一个关键因素。因此有必要研究ΔNp63α与硼替佐米耐药的相关性以及ΔNp63α在耐药中所起到的作用。
在正常生理状态下，蛋白酶体的β5亚基发挥类糜蛋白酶活性来降解泛素化后的蛋白质。硼替佐米共价结合于蛋白酶体的β5亚基，抑制了这部分蛋白酶体活性而使大量未折叠蛋白和错误折叠蛋白大量瞬间聚集，这可能诱发了内质网应激。内质网应激破坏了细胞稳态并可以产生未折叠蛋白反应，未折叠蛋白反应可以诱发过量ROS产生，反过来ROS也可以促进内质网应激，最终激活细胞凋亡导致细胞死亡。β5亚基是硼替佐米作用的关键点，因此，将探究头颈鳞状细胞癌耐药株中是否存在β5亚基的过表达或者突变来耐受硼替佐米的药物作用。
细胞珠蛋白(cytoglbin，CYGB)是珠蛋白家族成员之一，它具有紧凑的螺旋构象，并可以可逆的结合O2、NO、CO等双原子气体分子，已经证明了它具有抗氧化应激的功能。还有研究证实正常鳞状上皮细胞中的CYGB有清除过量的ROS保护细胞的作用。硼替佐米诱导细胞凋亡过程中有过量的ROS生成，CYGB是否介导了清除ROS的过程，目前尚无这方面的研究，推测头颈鳞状细胞耐药株的CYGB可能发挥清除过量ROS而抑制凋亡促进细胞存活的作用。为此，将进一步研究CYGB在这过程中的作用，证实ΔNp63α和CYGB的相互作用关系。
方法及结果：
第一部分验证头颈鳞状细胞癌中ΔNp63α表达水平与硼替佐米药物敏感性的关系
采用CCK8法检测硼替佐米对四株头颈鳞癌细胞株（UM-SCC-17A、UM-SCC-17B、UM-SCC-11和HN31）的毒性反应，测得IC50值。并通过Western-Blot和免疫荧光检测四株头颈鳞癌细胞株ΔNp63α的表达，发现UM-SCC-11和HN31两株细胞蛋白表达高，IC50值相对较高(分别为9.48nM和10.78nM);UM-SCC-17A和UM-SCC-17B两株细胞蛋白表达低，IC50值相对较低（分别为3.97nM和3.66nM）。通过对上述相对不敏感细胞株UM-SCC-17B进行体外逐步诱导耐药培养，得到继发耐药细胞株17B-R-10nM(IC50为：412.9nM)，其ΔNp63α表达明显升高。
第二部分评估ΔNp63α在硼替佐米头颈鳞状细胞癌耐药中的作用
通过慢病毒转染对ΔNp63α表达量高的细胞株HN31和继发耐药株17B-R-10nM进行敲减得到稳定转染株HN31shΔNp63α和17B-R-10nM-shΔNp63α，对ΔNp63α表达量低的UM-SCC-17B进行过表达得到稳定转染株17B-LVΔNp63α，经Western-Blot验证转染效率后，通过CCK8法检测硼替佐米对转染株的药物反应。
结果：显示：HN31shΔNp63α相对于HN31shNon，IC50由10.48nM降低为5.21nM;17B-LVΔNp63α相较于17B-LVNon，IC50由3.86nM提高到为13.31rnM;17B-R-10nM-shΔNp63α相对于对照组，由407.2nM降低为70.69nM。
通过接种上述稳转细胞株、耐药细胞株使裸鼠腋下成瘤，尾静脉注射硼替佐米治疗六周，观察裸鼠瘤体大小、裸鼠体重的变化，并记录裸鼠死亡的时间做生存分析。裸鼠瘤体大小变化结果显示：与HN31shNon+硼替佐米组和HN31shNon+生理盐水组瘤体相比，HN31shNon+生理盐水组瘤体生长最快(P＜0.001);与17B-LVNon+硼替佐米组和17B-LVΔNp63α+硼替佐米组相比，17B-LVΔNp63α+生理盐水组增长更快(P＜0.001);相对于亲本株+硼替佐米组，17B-R-10nM+硼替佐米组的瘤体体积生长更快(P＜0.001)。裸鼠体重显示：HN31shNon+生理盐水组(P＜0.001)、17B-LVΔNp63α+生理盐水组(P＜0.001)和17B-R-10nM+硼替佐米组(P＜0.001)在各组中体重降低最明显。生存分析结果显示：HN31shNon+生理盐水组、HN31shNon+硼替佐米组和HN31shΔNp63α+硼替佐米组中位生存时间分别是49天、60天和76天，其中HN31shNon+硼替佐米组和HN31shNon+生理盐水组之间有明显差异(P=0.009);17B-LVΔNp63α+生理盐水组、17B-LVΔNp63α+硼替佐米组和17B-LVNon+硼替佐米组中位生存时间分别是49天、57天和73天，其中17B-LVΔNp63α+生理盐水组和17B-LVΔNp63α+硼替佐米组之间有明显差异(P=0.027)，提示注射硼替佐米药物裸鼠寿命更长;17B-R-10nM+硼替佐米组和17B-P+硼替佐米组的中位生存时间为47天和67天，两组间有明显差异(P=0.006)。
第三部分ΔNp63α通过PSMB5诱发头颈鳞癌对硼替佐米耐药的机制研究
通过对头颈鳞癌亲本株、诱导耐药株、及各稳定转染株进行蛋白酶体活性检测，结果显示：相较亲本株，诱导耐药株蛋白酶体活性增强，但不同耐药指数的诱导耐药株之间的差异不明显;相较于HN31-shNon，HN31-shΔNp63α明显降低;相较于17B-LVNon，17B-LVΔNp63α明显升高。通过SNP检测，基因分型结果提示耐药株未发现PSMB5的基因突变。经Western-Blot检测PSMB5表达，结果显示：相较于亲本株17B-P、耐药株17B-R-5nM和17B-R-10nM的PSMB5表达升高，但两株耐药之间差异不明显;相较于17B-LVNon，过表达细胞株17B-LVΔNp63α的PSMB5明显增高;相较于HN31-shNon，敲减细胞株HN31-shΔNp63α的PSMB5降低。通过裸鼠瘤体免疫组化检测，结果显示：ΔNp63α蛋白以细胞核表达为主，PSMB5在细胞质和细胞核中均有表达，二者之间正相关，相关系数为0.343(P=0.002)。
第四部分ΔNp63α-CYGB-ROS调控头颈鳞癌对硼替佐米耐药的机制研究
经流式细胞仪检测硼替佐米作用头颈鳞癌细胞后的ROS水平，结果显示：药物作用后细胞内ROS大量产生，先升高后降低，最高值出现在5小时;敲减CYGB后细胞株的ROS产生升高;ΔNp63α过表达的细胞株ROS产生量少，ΔNp63α低表达的细胞株ROS产生量多。CYGB甲基化检测结果显示本研究使用的头颈鳞癌细胞株CYGB的启动子甲基化率非常低，各株总甲基化率最高不超过1％。经Western-Blot和免疫荧光检测CYGB的表达，结果显示：耐药株CYGB的表达升高;相比于对照，HN31shΔNp63α细胞株CYGB表达明显降低;相比于对照，17B-LVΔNp63α细胞株CYGB表达明显升高。通过裸鼠瘤体免疫组化检测，结果显示：CYGB主要在细胞质中表达，并且与ΔNp63α正相关，相关系数为0.464(P=0.019)。通过CHIP-seq检测，结果显示CYGB为ΔNp63α的转录调控位点。通过双荧光素酶报告基因检测，结果显示ΔNp63α能明显增强CYGB启动子活性。
结论：
1.ΔNp63α是头颈鳞状细胞癌耐药的关键因素，ΔNp63α高表达可以使头颈鳞癌对硼替佐米耐药性增强，ΔNp63α低表达可以使头颈鳞癌对硼替佐米耐药性降低。
2.相对于亲本株，在相对较低的耐药浓度中，诱导耐药株的蛋白酶体活性及PSMB5蛋白的表达升高，但随着耐药指数的增高，蛋白酶体活性及PSMB5蛋白的表达变化不明显。
3.头颈鳞状细胞癌中ΔNp63α的表达和PSMB5的表达相关。
4.头颈鳞状细胞癌中ΔNp63α调控CYGB表达，CYGB作为ΔNp63α的转录调控靶点，通过减少硼替佐米作用后产生的过量ROS挽救细胞凋亡，从而发挥耐药作用。
头颈癌是指一组发生在包括口腔、口咽、下咽、喉等部位的恶性肿瘤。小分子靶向药日益成为重要的辅助治疗手段。它能够特异性的识别并杀伤肿瘤细胞，有潜在的应用前景。在过去的十几年中，蛋白酶体抑制剂在血液系统恶性肿瘤治疗中的应用已大大扩展，2003年硼替佐米（万珂）被FDA批准用于复发性多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤治疗，至今它已在骨髓瘤和小儿/成人急性白血病患者的疗效上取得重大进步，但是在头颈肿瘤等实体瘤的治疗上却进展缓慢。导致这一结果的原因很多，实体肿瘤细胞内固有的耐药机制可能是其最主要的原因。
一般来说，细胞内的某些蛋白质的突变，过表达或者持续性激活都可能会促使耐药产生。这些蛋白质可以通过激活或者抑制某些细胞通路，使肿瘤细胞在药物压力下不发生凋亡，从而降低对药物的敏感性。肿瘤测序研究显示约有20％-25％的头颈鳞状细胞癌出现TP63的扩增，ΔNp63亚型过表达更为常见，超过80％的头颈鳞状细胞癌病例中ΔNp63α亚型上调。ΔN亚型是p63的显性失活形式，可以通过抑制细胞周期调控蛋白p21的转录，促进肿瘤细胞的增殖。在头颈鳞癌细胞中，高表达的ΔNp63α能保护细胞、避免凋亡，可以被视为预后的一个标志物。课题组前期通过药物敏感性筛选平台的研究发现，不同的头颈鳞癌细胞株对硼替佐米敏感性有明显的差异，并发现个别相对敏感的头颈鳞癌细胞株的ΔNp63α的表达量较少。根据这个发现，推测ΔNp63α可能是头颈鳞癌细胞对硼替佐米发生耐药的一个关键因素。因此有必要研究ΔNp63α与硼替佐米耐药的相关性以及ΔNp63α在耐药中所起到的作用。
在正常生理状态下，蛋白酶体的β5亚基发挥类糜蛋白酶活性来降解泛素化后的蛋白质。硼替佐米共价结合于蛋白酶体的β5亚基，抑制了这部分蛋白酶体活性而使大量未折叠蛋白和错误折叠蛋白大量瞬间聚集，这可能诱发了内质网应激。内质网应激破坏了细胞稳态并可以产生未折叠蛋白反应，未折叠蛋白反应可以诱发过量ROS产生，反过来ROS也可以促进内质网应激，最终激活细胞凋亡导致细胞死亡。β5亚基是硼替佐米作用的关键点，因此，将探究头颈鳞状细胞癌耐药株中是否存在β5亚基的过表达或者突变来耐受硼替佐米的药物作用。
细胞珠蛋白(cytoglbin，CYGB)是珠蛋白家族成员之一，它具有紧凑的螺旋构象，并可以可逆的结合O2、NO、CO等双原子气体分子，已经证明了它具有抗氧化应激的功能。还有研究证实正常鳞状上皮细胞中的CYGB有清除过量的ROS保护细胞的作用。硼替佐米诱导细胞凋亡过程中有过量的ROS生成，CYGB是否介导了清除ROS的过程，目前尚无这方面的研究，推测头颈鳞状细胞耐药株的CYGB可能发挥清除过量ROS而抑制凋亡促进细胞存活的作用。为此，将进一步研究CYGB在这过程中的作用，证实ΔNp63α和CYGB的相互作用关系。
方法及结果：
第一部分验证头颈鳞状细胞癌中ΔNp63α表达水平与硼替佐米药物敏感性的关系
采用CCK8法检测硼替佐米对四株头颈鳞癌细胞株（UM-SCC-17A、UM-SCC-17B、UM-SCC-11和HN31）的毒性反应，测得IC50值。并通过Western-Blot和免疫荧光检测四株头颈鳞癌细胞株ΔNp63α的表达，发现UM-SCC-11和HN31两株细胞蛋白表达高，IC50值相对较高(分别为9.48nM和10.78nM);UM-SCC-17A和UM-SCC-17B两株细胞蛋白表达低，IC50值相对较低（分别为3.97nM和3.66nM）。通过对上述相对不敏感细胞株UM-SCC-17B进行体外逐步诱导耐药培养，得到继发耐药细胞株17B-R-10nM(IC50为：412.9nM)，其ΔNp63α表达明显升高。
第二部分评估ΔNp63α在硼替佐米头颈鳞状细胞癌耐药中的作用
通过慢病毒转染对ΔNp63α表达量高的细胞株HN31和继发耐药株17B-R-10nM进行敲减得到稳定转染株HN31shΔNp63α和17B-R-10nM-shΔNp63α，对ΔNp63α表达量低的UM-SCC-17B进行过表达得到稳定转染株17B-LVΔNp63α，经Western-Blot验证转染效率后，通过CCK8法检测硼替佐米对转染株的药物反应。
结果：显示：HN31shΔNp63α相对于HN31shNon，IC50由10.48nM降低为5.21nM;17B-LVΔNp63α相较于17B-LVNon，IC50由3.86nM提高到为13.31rnM;17B-R-10nM-shΔNp63α相对于对照组，由407.2nM降低为70.69nM。
通过接种上述稳转细胞株、耐药细胞株使裸鼠腋下成瘤，尾静脉注射硼替佐米治疗六周，观察裸鼠瘤体大小、裸鼠体重的变化，并记录裸鼠死亡的时间做生存分析。裸鼠瘤体大小变化结果显示：与HN31shNon+硼替佐米组和HN31shNon+生理盐水组瘤体相比，HN31shNon+生理盐水组瘤体生长最快(P＜0.001);与17B-LVNon+硼替佐米组和17B-LVΔNp63α+硼替佐米组相比，17B-LVΔNp63α+生理盐水组增长更快(P＜0.001);相对于亲本株+硼替佐米组，17B-R-10nM+硼替佐米组的瘤体体积生长更快(P＜0.001)。裸鼠体重显示：HN31shNon+生理盐水组(P＜0.001)、17B-LVΔNp63α+生理盐水组(P＜0.001)和17B-R-10nM+硼替佐米组(P＜0.001)在各组中体重降低最明显。生存分析结果显示：HN31shNon+生理盐水组、HN31shNon+硼替佐米组和HN31shΔNp63α+硼替佐米组中位生存时间分别是49天、60天和76天，其中HN31shNon+硼替佐米组和HN31shNon+生理盐水组之间有明显差异(P=0.009);17B-LVΔNp63α+生理盐水组、17B-LVΔNp63α+硼替佐米组和17B-LVNon+硼替佐米组中位生存时间分别是49天、57天和73天，其中17B-LVΔNp63α+生理盐水组和17B-LVΔNp63α+硼替佐米组之间有明显差异(P=0.027)，提示注射硼替佐米药物裸鼠寿命更长;17B-R-10nM+硼替佐米组和17B-P+硼替佐米组的中位生存时间为47天和67天，两组间有明显差异(P=0.006)。
第三部分ΔNp63α通过PSMB5诱发头颈鳞癌对硼替佐米耐药的机制研究
通过对头颈鳞癌亲本株、诱导耐药株、及各稳定转染株进行蛋白酶体活性检测，结果显示：相较亲本株，诱导耐药株蛋白酶体活性增强，但不同耐药指数的诱导耐药株之间的差异不明显;相较于HN31-shNon，HN31-shΔNp63α明显降低;相较于17B-LVNon，17B-LVΔNp63α明显升高。通过SNP检测，基因分型结果提示耐药株未发现PSMB5的基因突变。经Western-Blot检测PSMB5表达，结果显示：相较于亲本株17B-P、耐药株17B-R-5nM和17B-R-10nM的PSMB5表达升高，但两株耐药之间差异不明显;相较于17B-LVNon，过表达细胞株17B-LVΔNp63α的PSMB5明显增高;相较于HN31-shNon，敲减细胞株HN31-shΔNp63α的PSMB5降低。通过裸鼠瘤体免疫组化检测，结果显示：ΔNp63α蛋白以细胞核表达为主，PSMB5在细胞质和细胞核中均有表达，二者之间正相关，相关系数为0.343(P=0.002)。
第四部分ΔNp63α-CYGB-ROS调控头颈鳞癌对硼替佐米耐药的机制研究
经流式细胞仪检测硼替佐米作用头颈鳞癌细胞后的ROS水平，结果显示：药物作用后细胞内ROS大量产生，先升高后降低，最高值出现在5小时;敲减CYGB后细胞株的ROS产生升高;ΔNp63α过表达的细胞株ROS产生量少，ΔNp63α低表达的细胞株ROS产生量多。CYGB甲基化检测结果显示本研究使用的头颈鳞癌细胞株CYGB的启动子甲基化率非常低，各株总甲基化率最高不超过1％。经Western-Blot和免疫荧光检测CYGB的表达，结果显示：耐药株CYGB的表达升高;相比于对照，HN31shΔNp63α细胞株CYGB表达明显降低;相比于对照，17B-LVΔNp63α细胞株CYGB表达明显升高。通过裸鼠瘤体免疫组化检测，结果显示：CYGB主要在细胞质中表达，并且与ΔNp63α正相关，相关系数为0.464(P=0.019)。通过CHIP-seq检测，结果显示CYGB为ΔNp63α的转录调控位点。通过双荧光素酶报告基因检测，结果显示ΔNp63α能明显增强CYGB启动子活性。
结论：
1.ΔNp63α是头颈鳞状细胞癌耐药的关键因素，ΔNp63α高表达可以使头颈鳞癌对硼替佐米耐药性增强，ΔNp63α低表达可以使头颈鳞癌对硼替佐米耐药性降低。
2.相对于亲本株，在相对较低的耐药浓度中，诱导耐药株的蛋白酶体活性及PSMB5蛋白的表达升高，但随着耐药指数的增高，蛋白酶体活性及PSMB5蛋白的表达变化不明显。
3.头颈鳞状细胞癌中ΔNp63α的表达和PSMB5的表达相关。
4.头颈鳞状细胞癌中ΔNp63α调控CYGB表达，CYGB作为ΔNp63α的转录调控靶点，通过减少硼替佐米作用后产生的过量ROS挽救细胞凋亡，从而发挥耐药作用。