稀有糖,是在自然界存在,但含量极少的一类单糖及其衍生物,一般具有低热量、低吸收等特点。随着生活水平的提高,人们对保健食品和养生的追求也越来越高,传统高能量甜味剂如蔗糖等有被低热量、功能性糖取代的趋势。近年来,稀有糖已成为研究的热点。稀有糖种类繁多,不同种类的稀有糖具有各自独特的生理功能,在食品、医药、化妆品等行业具有巨大的应用前景。其中,D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖,甜度相当于蔗糖,能量值为0.007 kcal/g,被称为无能量的甜味剂,具有重要的生理功能,如降低血糖、血脂,清除活性氧自由基和神经保护等作用。D-阿洛糖是由D-阿洛酮糖为直接底物催化生成的另一种重要的稀有糖,具有多种生理功能。特别是由于其优异的抑癌作用以及辅助癌症放、化疗的作用,成为研究热点。然而,目前关于D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的研究还不够全面和系统,加之稀有糖的分离纯化问题。使得D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的产量低、价格昂贵,限制了它们的推广和应用。基于上述问题,本文从低成本,高效率生产D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的目的出发。综合运用多学科技术,如微生物学,分子生物学,生物反应工程,数学建模和优化,实现技术的重点突破和高度集成,建立先进的生产与分离工艺,实现了 D-阿洛酮糖的低成本生产。然后,以生产得到的D-阿洛酮糖为底物,以L-鼠李糖异构酶为催化剂,催化得到了 D-阿洛糖。进一步以固定化酶D-阿洛酮糖3-差向异构酶和L-鼠李糖异构酶混合酶制剂为催化剂,以价格便宜的D-果糖为底物,催化生产得到了 D-阿洛糖。为进一步的工业化大生产提供了理论依据和技术支持。主要包括以下几个方面的研究:一、以大肠杆菌为宿主菌,实现DPEase的可溶性表达以Ruminococcus sp.的dpe基因序列（5₁₃9BFAA）为基础,根据在线密码子库http://www.kazusa.or.jp/codon/,利用在线密码子优化软件http://gcua.schoedl.de/,对dpe基因序列中的大肠杆菌的稀有密码子进行了优化。然后,利用软件DNASTAR（GeneQuest）分析了优化前后基因的mRNA二级结构,优化后的mRNA二级结构折叠自由能为-131.71 kJ/mol,高于优化前的-152.56kJ/mol。并且优化后基因mRNA二级结构松散,有利于提高翻译效率。最后,通过基因合成的手段,得到了优化的基因序列dpeY。为了比较3种表达质粒pET-22b,带类泛素标签的pET-28a-SUMO和含MBP标签的pMAL-c2x对DPE酶表达的影响,成功构建了表达质粒pET-22b-dpeY,pET-28a-SUMO-dpeY和pMAL-c2x-dpeY,以大肠杆菌为宿主,最终选择确定了pET-22b-dpeY质粒。另外,将质粒pET-22b-dpeY转化含有分子伴侣-GroEL/GroES的大肠杆菌E.coli BL21-GroEL/GroES（DE3）,进一步研究了分子伴侣-GroEL/GroES 对 DPE 酶可溶性表达的影响。最终发现,分子伴侣-GroEL/GroES可促进DPE酶的可溶性表达,并且重组菌E.coli BL21-GroEL/GroES-pET-22b-dpeY较重组菌E.coli BL21-pET-22b-dpeY容易破碎,更容易获得DPE酶的粗蛋白溶液。二、DPEase的固定化及酶转化法生产D-阿洛酮糖通过在DPE酶的C端添加12个谷氨酸和天冬氨酸酸性氨基酸交替侧链的方法,利用离子交换树脂的吸附作用,实现了 DPE酶的固定化。添加的酸性氨基酸侧链（-DDEDEDEDEDED）可以改变DPE酶的等电点（PI）,带侧链的C12-DPE酶与普通DPE酶相比,在相同pH值条件下,|pI-pH|更大,蛋白带的电荷更多,与离子交换树脂的吸附更牢固。首先,比较了不同型号的离子交换树脂对C12-DPE酶固定化的影响,优选D301树脂为固定化载体,并利用单因素和正交试验对影响酶固定化的4个重要因素进行了优化,得到了固定化的最佳方案:固定化载体g:酶U=1:150,固定化pH为8.0,固定化温度为10℃,固定化时间为5 h。利用优化的固定化方案得到的C12-DPE固定化产率达到91%,固定化酶的活性达到60.8±2.1 U/g。然后,比较了固定化酶与游离酶的酶学性质,两者的最适pH值均为8.0,最适温度是60℃,固定化的C12-DPE具有较广的pH和温度适用范围,并且,具有较好的热稳定性和重复利用稳定性,重复利用15次后,仍保留70%以上的酶活。最后,利用固定化的C12-DPE进行D-阿洛酮糖的生产,每毫升转化液加入0.5 g固定化酶,转化100 g/L的D-果糖溶液约6 h,可得到30%的D-阿洛酮糖。三、以短芽孢杆菌SP3为宿主菌,实现DPEase的分泌表达将dpe基因插入质粒pNCMO2,成功获得重组质粒pNCMO2-dpe。并以短芽孢杆菌SP3为宿主菌,利用电穿孔转化法构建得到重组菌SP3-pNCMO2-dpe。优化重组菌的表达条件发现,重组菌发酵72 h后达到最高的蛋白表达量,并且目的蛋白在培养基上清液实现了分泌表达,利用Western-blot技术分析了培养基上清中分泌蛋白的含量,约占60%。进一步,利用离子交换树脂D301与培养基上清液直接混合吸附的方法得到了固定化酶,简化了酶的固定化步骤。最后,利用壳聚糖和海藻酸钠的絮凝作用,实现了重组菌SP3-pNCMO2-dpe细胞的固定化,利用固定化的细胞进行D-阿洛酮糖的生产,每毫升转化液加入OD600为20的重组菌,转化100 g/L的D-果糖溶液约6 h,可以得到29.3%的D-阿洛酮糖。四、D-阿洛酮糖的分离纯化利用SMB和生物酶转化方法实现了 D-阿洛酮糖与D-果糖的分离,分别可得到纯度为98.5%和91.2%的D-阿洛酮糖。并且纯度达80%以上的D-阿洛酮糖可通过结晶获得高纯度产品,纯度可达99%以上。其中,生物酶转化法分离纯化的原理是,首先利用固定化葡萄糖异构酶（GI）的作用使D-果糖与D-阿洛酮糖混合溶液中的部分D-果糖转化生成D-葡萄糖,然后利用固定化葡萄糖氧化酶（GOD）的作用使生成的D-葡萄糖转化为葡萄糖酸。经过两种酶的循环处理,待混合溶液中的D-果糖全部转化为葡萄糖酸,可以利用离子交换树脂D309的吸附作用吸附除去葡萄糖酸,最终得到含高浓度D-阿洛酮糖的溶液。另外,在生物酶转化法中,根据固定化的葡萄糖异构酶与葡萄糖氧化酶的酶动力学参数,设计并形成了除D-果糖的连续搅拌反应器（CSTR-CSTR）装置,并建立了除D-果糖的数学模型。五、D-阿洛酮糖的脱色与结晶分析比较了过氧化氢氧化、树脂吸附和活性炭吸附3种脱色方法对D-阿洛酮糖的脱色作用,得到了最佳的脱色方法为活性炭吸附法。进一步,利用单因素和正交试验得到最优的脱色方案:活性炭使用量为3%,加热温度为60℃,吸附时间为60min。利用最优的方案处理糖溶液,得到较好的效果,脱色率达到了89%。基于分离得到的D-阿洛酮糖溶液,研究了有机溶剂析出和降温两种方法对D-阿洛酮糖的结晶作用,并比较了两种方法形成的结晶体,优选降温法为D-阿洛酮糖的结晶方法。其具体步骤为:利用旋转蒸发仪浓缩糖溶液,直至其糖度大于75,然后,加入400目的0.1%的D-阿洛酮糖晶种,最后,温度由65℃降温至4℃,约20 h后结晶完成。通过此方法得到的D-阿洛酮糖结晶体的纯度达到了 99.6%,与市面上销售的标准品试剂纯度相当。六、L-RhIase的表达、固定化及酶转化法生产D-阿洛糖首先,成功克隆得到了来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的L-鼠李糖异构酶（L-RhI）基因l-rhi,并构建了表达质粒pET-22b-l-rhi。为了比较宿主菌E.coliBL21（DE3）,E.coli BL21star（DE3）和E.coli Transetta（DE3）对L-RhI酶异源表达的影响,构建获得了重组菌 BL21-pET-22b-l-rhi,BL21star-pET-22b-l-rhi 和Transetta-pET-22b-l-rhi。研究比较,宿主菌 E.coli BL21star（DE3）因含有能够增强菌株细胞内mRNA稳定性的rne131基因突变体,从而更有利于L-RhI酶的表达。进一步,以重组菌BL21 star-pET-22b-l-rhi表达的L-RhI酶为基础,比较了不同树脂载体对L-RhI酶固定化的影响,优选戊二醛交联的氨基树脂为固定化载体,并利用单因素和正交试验优化得到了固定化的最佳方案:固定化介质（g）与酶活力（U）比例为1:120,戊二醛交联浓度为2%,固定化温度为25℃,固定化时间为10h。通过最优方案得到的固定化酶产率达到89.5%,固定化后的酶活力达到48.5±1.1 U/g。然后,研究了固定化L-R hIase的酶学性质。固定化酶L-RhI的最适pH值为9.0,最适温度70℃,并且较游离的酶有更广的pH值适用范围和更高的热稳定性,重复利用10次,酶活力仍能保持78%以上。以固定化酶L-RhI为催化剂,以10 g/L的D-阿洛酮糖为底物,70℃催化反应7 h,可得到约27.5%的D-阿洛糖。最后,成功利用一步反应直接从价格便宜的D-果糖生产得到了 D-阿洛糖。以固定化的DPEase和固定化的L-RhIase混合酶制剂为催化剂,以100 g/L的D-果糖为底物,65℃催化反应7 h,可得到D-果糖,D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的比例为 6.0:2.4:1.6。