小麦条锈菌是严格专性寄生真菌,其引致的小麦条锈病在中国乃至世界小麦主产区造成严重的危害。优良抗性品种的培育是防治条锈病大规模流行的主要策略之一。而条锈菌频繁变异导致的品种抗性不断“丧失”是该病害爆发流行的主要原因。该研究以揭示条锈菌致病机理为基础,转基因技术与遗传育种手段有机结合,对开发条锈病持续有效防控的策略具有重要意义。本研究在小麦条锈菌CYR32基因组测序和分泌蛋白组的基础上,利用农杆菌介导的PVX(potato virus X)系统在烟草中鉴定Pst＿A23能够抑制由促细胞凋亡蛋白Bax(BCL2-associated X)诱导的细胞坏死。进一步条锈菌重要效应蛋白Pst＿A23进行了功能探究,明确了其在条锈菌侵染致病过程中的作用、互作靶标以及调控的抗性通路。研究首次揭示条锈菌效应蛋白作为可变剪切调节子抑制寄主植物免疫的致病机理,丰富了我们对活体营养型寄生真菌侵染致病的认识,为全面揭示病原菌的致病机理奠定了理论基础,进而为小麦条锈病持续有效防控策略的制定提供了科学依据。主要结果如下:1.效应蛋白Pst＿A23的序列特征分析Pst＿A23富含丝氨酸、赖氨酸和精氨酸所占比重较大,三种氨基酸分别占11.6%,6.2%和13.0%。BLASTX序列分析比对发现Pst＿A23是条锈菌特异的效应蛋白。在6个小麦条锈菌生理小种CYR32、PST-130、PST-21、PST-43、PST-08/21、PST-87/7的序列分析发现Pst＿A23没有核苷酸位点的变化,表明该效应蛋白在种内有着较高的保守性。2.效应蛋白Pst＿A23功能分析酵母分泌系统以及烟草上亚细胞定位证明Pst＿A23的信号肽具有分泌功能。瞬时表达Pst＿A23可抑制由Flg22、荧光假单胞菌诱导的胼胝质的产生以及抗性相关基因的表达。q RT-PCR分析发现Pst＿A23在条锈菌侵染24 hpi(hour post inoculation)和48 hpi呈现高诱导表达。利用寄主诱导的瞬时沉默技术(HIGS,host induced gene silencing)沉默Pst＿A23后,条锈菌产孢量降低,生物量显著减少,菌丝长度、侵染面积显著减小,并伴随着寄主细胞坏死面积的增加。Pst＿A23 RNAi(RNAi,RNA interference)小麦转基因材料L2和L10株系鉴定结果表明,与对照相比,条锈菌的致病性显著下降,伴随着产孢量降低、菌丝生长发育严重受阻和寄主细胞坏死增多。另外,过表达Pst＿A23材料L5和L7株系,在接种条锈菌CYR31后,与对照相比,过表达植株上产孢量明显增多,生物量显著增加,说明过表达Pst＿A23有助于条锈菌的致病。3.效应蛋白Pst＿A23调控可变剪切的机制解析烟草上亚细胞定位发现,Pst＿A23特异性集中在植物细胞核,呈现不均一的点状。利用剪切体标记蛋白At SR45共定位发现,Pst＿A23与At SR45的定位在细胞核核斑点上存在高度拟合。突变C端富含精氨酸(R)区域R2-rich结构域,该蛋白失去定位于核斑点的能力,表明R2-rich结构对Pst＿A23的亚细胞定位是必需的。通过免疫共沉淀与质谱技术筛选获得了两个候选靶标Ta SR34和Ta U1,并通过双分子荧光互补实验、荧光素酶互补实验、微量热泳动和免疫共沉淀技术确认了Ta SR34与Pst＿A23、Pst＿A23与Ta U1存在互作。为探究Pst＿A23能否调控寄主基因的表达,对过表达Pst＿A23小麦植株进行转录组测序,结果表明过表达Pst＿A23植株上有1278个显著差异表达的基因,其中,上调基因911个,下调基因367个。KEGG注释发现,差异基因主要富集在激素信号、蛋白质加工、植物与病原菌互作等通路。转录组分析鉴定到782个显著差异的可变剪切事件(P<0.05,|Δpsi|>0.1),包括267个5’端剪切、205个内含子滞留、177个3’端剪切、142个外显子跳跃和1个互斥外显子事件。半定量结果分析表明差异可变剪切基因Traes CS6A02G254500和Traes CS2A02G510800的剪切效率下降,基因Traes CS1D02G241000、Traes CS6D02G182300和Traes CS7D02G272500的剪切效率升高。定量实验确定了Ta WRKY53和Ta Xa21的可变剪切效率严重下降导致Ta WRKY53和Ta Xa21转录本降低。此外,Ta WRKY53和Ta Xa21瞬时沉默后,条锈菌菌丝长度和侵染面积显著增加,寄主细胞坏死面积较对照组显著增大,且Ta PR1和Ta PR2表达在接种条锈菌48和120 hpi显著下降。表明Pst＿A23调控寄主pre-m RNA可变剪切参与条锈菌与小麦的互作。另外,利用MEME(Motif-based sequence analysis tools)评估了可变剪切基因的剪接位点上下游50 bp内保守的RNA基序元件,发现其中GAAGA、UCUGC和UUCUU基序元件分别为61745,52458和41390条,占总数的17.7%,15.1%和11.9%。RNA凝胶阻滞实验(RNA-EMSA)和微量热泳动技术证明了Pst＿A23蛋白能够与保守的RNA基序元件(GAAGA,UCUGC和UUCUU)结合,且C端R-rich区域有助于Pst＿A23与靶标RNA的结合。4.Ta SR34剪切因子在小麦抗条锈中起正调控作用Ta SR34定位于小麦染色体2A、2D上,染色体2B上Ta SR34(暂命名Ta SR34L)比染色体2A、2D上的核酸序列长180 bp。烟草亚细胞定位结果表明Ta SR34蛋白存在两种定位分布,一种充斥着整个细胞核,一种是分布在核斑点上,且Ta SR34与效应蛋白Pst＿A23共定位在细胞核核斑点上。而Ta SR34L定位分布于细胞质、细胞核和细胞膜。q RT-PCR分析发现,在小麦与条锈病亲和互作中,Ta SR34的表达量无显著性变化。在非亲和互作中,染色体2A上的Ta SR34不表达,2B上的Ta SR34L无显著变化,2D上Ta SR34的表达量在接菌24 hpi和48 hpi上调至3倍和7倍。另外,在亲和互作中分别沉默Ta SR34和Ta SR34L后,表型没有显著差异。但在非亲和互作中,沉默Ta SR34后寄主叶片上产生少量孢子堆,条锈菌的生物量、菌丝长度、侵染面积和吸器数目明显增加,Ta PR1和Ta PR2表达显著下调,寄主细胞的坏死面积显著减小。而沉默Ta SR34L后,条锈菌生长发育、寄主的抗性反应无显著变化,表明小麦染色体2D上的Ta SR34在小麦抗病反应中起正向调控作用。Ta SR34-RNAi转基因材料株系孢子堆明显增加,Ta PR1和Ta PR2的表达显著下降,表明沉默Ta SR34降低小麦对条锈菌的抗性。5.Ta SR34激活拟南芥SA(salicylic acid)通路,增强拟南芥抗性为了明确Pst＿A23是否通过靶标Ta SR34抑制植物的免疫,首先在烟草上瞬时表达Ta SR34,发现Ta SR34能够诱导细胞坏死,而Ta SR34L没有产生明显的细胞坏死。Ta SR34过表达拟南芥呈现植株矮化且叶片边缘坏死的类病斑症状。Flg22处理后的过表达Ta SR34拟南芥植物叶片胼胝质显著性增多,基础免疫相关基因At PR1、At WRKY33和At WRKY53显著上调表达。同时,Ta SR34过表达拟南芥的转录组测序分析鉴定到差异基因4228个,上调差异基因有2389个,下调差异基因1839个。KEGG注释分析发现下调基因富集的通路主要有光合作用、植物激素信号转导途径、光合作用中的碳固定、碳代谢途径等。上调基因主要富集在苯丙素的生物合成、植物病原菌互作以及内质网蛋白加工等。另外,q RT-PCR显示SA生物合成关键基因At PAL1、At PAL4和At EDS16显著上调表达。ELISA检测过表达植株叶片中总SA的含量显著上升。表明Ta SR34通过调控植物的SA生物合成代谢参与植物的抗性反应。6.Ta SR34剪切因子调控拟南芥抗性相关基因的可变剪切过表达Ta SR34拟南芥转录组测序发现显著差异的可变剪切事件总共有65个,包含61个拟南芥相关基因。随机选取了6个差异基因进行剪切效率检测,发现这些基因剪切效率明显出现不同程度的上调或下调。其中,At TGA6参与SA通路的调控,剪切效率出现上调,导致功能性TGA6转录本上升。At LSD1是拟南芥类病变植株相关基因,与SA调控抗逆性相关。At LSD1基因转录本的第二个内含子出现滞留,导致植株类病斑的产生。同时,双分子荧光互补、微量热泳动和免疫共沉淀技术确认了Ta SR34与Ta U1存在互作,而且Pst＿A23与Ta U1的互作强度要强于Ta SR34与Ta U1的互作。Ta SR34调节的剪接位点的RNA基序元件与Pst＿A23调节的存在高度相似性,且RNA-EMSA实验证实了Ta SR34能够与Pst＿A23的靶标RNA相结合,表明Ta SR34与Pst＿A23可能拥有共同调节剪接位点的RNA基序元件。综上,Pst＿A23蛋白可能竞争性结合Ta U1,“架空”Ta SR34蛋白,直接和RNA基序元件结合调控pre-m RNA,削弱植物的抗性反应。