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目的:
最新资料支持牙周炎是心血管疾病(CVD)的独立危险因素之一,探索两者相关联的生物学机制已成为全新的研究领域。近来血清流行病学、动物和细胞分子学研究发现:作为慢性牙周炎主要致病菌之一的P.g入血后可侵入血管壁,参与动脉粥样硬化(AS)的发生发展。巨噬细胞形成泡沫细胞是AS发生发展的关键事件。本研究以THP-1来源的巨噬细胞为研究对象,观察P.g-LPS对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响;并从基因和蛋白水平探讨该过程中巨噬细胞胆固醇代谢关键分子的表达变化,旨在初步阐明P.g感染在牙周炎与CVD相关性中的生物学机制,为CVD的早期干预和防治提供实验和理论支持。
方法:
THP-1单核细胞培养于RPMI1640完全培养液中,用终浓度为160nmol/L佛波酯(PMA)诱导THP-1单核细胞48h,使其分化为巨噬细胞。在负荷50μg/ml LDL的条件下,分别用浓度为0.1、1、10μg/mlP.g-LPS与巨噬细胞共孵育48 h;1μg/ml P.g-LPS巨噬细胞共孵育0h、24 h、48 h、72 h。采用油红O染色和胆固醇测定法观察和检测细胞浆内脂滴和细胞内胆固醇酯含量的变化;进一步运用Real-time PCR和Westernblot检测细胞胆固醇代谢关键分子CD36、LOX-1、ACAT1和ABCG1mRNA和蛋白表达的变化。
结果:
1.经160 nmol/L PMA诱导48h后,THP-1细胞由悬浮转化为贴壁状态,细胞形态变成梭形或椭圆形,细胞体积增大,成为巨噬细胞。抗胰蛋白酶消化能力试验鉴定巨噬细胞。
2.与阴性对照组比较,阳性对照组其细胞内的脂滴显著增多,胆固醇酯与总胆固醇(CE/TC)的比值明显增加(>50%)(p<0.05)。1μg/ml和10μg/ml P.g-LPS组细胞浆内可见大量的红色脂滴,脂滴面积比细胞核要大,提示在形态上巨噬细胞已转化为泡沫细胞;通过胆固醇测定细胞内的TC和CE,与阴性对照组相比,随着P.g-LPS浓度升高,细胞内的CE/TC的比值也逐渐升高(P<0.05),当P.g-LPS浓度为10μg/ml,CE/TC的比值达到峰值。1μg/mlP.g-LPS组,随着P.g-LPS孵育时间的延长,细胞内的脂滴逐渐增多、CE/TC的比值逐渐升高(P<0.05),当P.g-LPS孵育时间72h时,细胞内红色脂滴最多,CE/TC的比值达到了62%。
3.与阴性对照组相比,P.g-LPS浓度组中,随着P.g-LPS浓度的增加,细胞内CD36和ABCG1的mRNA和蛋白表达均逐渐下降(P<0.05),当P.g-LPS为10μg/ml时,CD36的mRNA和蛋白表达均降低了约50%; ABCG1的mRNA和蛋白表达分别下降了53%和64%。细胞内ACAT1的mRNA和蛋白表达均逐渐升高(P<0.05),当P.g-LPS为10μg/ml时,ACAT1的mRNA和蛋白表达升高了约2倍和2.4倍。细胞内LOX-1的mRNA和蛋白表达无明显变化(P>0.05)。
4.随着1μg/ml P.g-LPS孵育时间的延长,细胞内CD36和ABCG1的mRNA和蛋白表达下降(P<0.05),与0h相比,72h组CD36的mRNA和蛋白表达分别下降至43%和56%;ABCG1的mRNA和蛋白表达下降至35%和37%。细胞内ACAT1的mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),与0h相比,72h组ACAT1的mRNA和蛋白表达分别升高了3倍和2.5倍;细胞内LOX-1的mRNA和蛋白表达无明显变化(P>0.05)。
结论:
1.成功建立了巨噬细胞和泡沫细胞模型。
2.P.g-LPS与巨噬细胞共孵育后可显著促进其形成泡沫细胞。
3.P.g-LPS可能通过上调巨噬细胞内ACAT1及下调巨噬细胞内CD36和ABCG1,从而导致巨噬细胞内胆固醇代谢紊乱,最终使巨噬细胞转化为泡沫细胞。但LOX-1可能没有参与此过程。