目的：手足口病(hand,footand mouth disease,HFMD)是一种常见的儿童传染病,其病原体型别众多,除CA16和EV71外,还有其它肠道病毒。本研究采用从阜阳地区HFMD患儿标本中分离病毒的方法得到EV71、CA16分离株和其他肠道病毒分离株;利用分子生物学技术以其他肠道病毒的基因组为模板,扩增肠道病毒VP4基因序列,确定该毒株的型别:并对典型的分离株进行分子流行病学分析,了解其核苷酸及氨基酸变异情况,构建系统进化树;同时扩增EV71分离株的全基因组序列并测序,与国内外EV71毒株进行同源性比较和进化分析,了解阜阳地区HFMD流行病原谱和EV71分离株的分子流行病学特征,为手足口病的防治及疫苗研究工作提供参考。　　方法：本研究主要由四部分内容组成:(1)HFMD患儿咽拭子标本的病毒分离与鉴定:首先将采自临床诊断为HFMD的患儿的133份咽拭子标本分别接种RD细胞和HEp-2细胞进行病毒分离。将分离得到的可疑病毒株利用透射电镜进行形态学观察,同时用肠道病毒通用引物、EV71型特异性引物和CA16型特异性引物进行Real-timeRT-PCR检测,以对分离物进行初步的型别鉴定;(2)非EV71非CA16肠道病毒株的鉴定及其VP4基因分型研究:对Real-timeRT-PCR检测鉴定为肠道病毒,但又不是EV71和CA16的病毒株扩增其VP4基因序列并测序,测序结果与GenBank肠道病毒核苷酸序列经BLAST比对确定其型别,并对其核苷酸序列进行同源性比较和进化分析;(3)对通过VP4比对鉴定为脊髓灰质炎病毒(Polioviruses,PV)的毒株VP1基因片段进行PCR产物的限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)分析,并扩增其VP1片段,将其插入至pMD18-Tsimple克隆载体,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,进行PCR鉴定及序列测定,并将序列与Sabin1标准株的VP1序列进行比对;(4)EV71地方流行株的全基因组序列扩增和测序:选取三株经Real-timeRT-PCR检测鉴定为EV71的分离株进行中和实验鉴定,扩增其全基因组序列,连接T载体后转化到克隆载体中,提取质粒鉴定后并测序,将该核苷酸序列与国内外EV71毒株进行同源性比较和进化分析。　　结果：(1)本次研究中,从133例患儿标本中分离出疑似肠道病毒株52例,病毒分离阳性率为39.1％(52/133)。经透射电镜观察发现,在RD细胞胞浆中,可见直径约30nm的球形无包膜肠道病毒样颗粒;通过荧光PCR鉴定为EV71为11株,占阳性比例为21.2%;CA16有5株,占阳性比例为9.6%;非EV71非CA16的其他肠道病毒36株,占阳性比例为69.2%。(2)成功扩增了36株非EV71非CA16其他肠道病毒的VP4片段,通过测序比对确定了34株的型别,病毒型别分布较为广泛,既有柯萨奇A组病毒,也有柯萨奇B组病毒和脊髓灰质炎病毒(PV),几组病毒伴随同时流行,其中CA10所占的比例最高(52.8%),其次为CA4(13.9%);(3)对确定为PV的FY11039号毒株VP1基因进行PCR-RFLP,分析发现经HaeⅢ、DdeⅠ内切酶作用后FY11039与标准株Sabin1的图谱一致,提示它们属于同一型,但经HpaⅡ内切酶作用后,FY11039与标准株Sabin1的图谱不一致,在对其VP1基因进行分析发现126位核苷酸存在突变,由G突变成A,而对其氨基酸序列进行比对发现序列并未发生变异;(4)对三株EV71分离株进行全基因组扩增,通过分析发现,它们与EV71A型代表株BrCr的同源性较低(79.55%～79.64%);与C4亚型的同源性较高(92.25%～99.60%)。　　结论：(1)基于VP4基因扩增和序列测定方法可以快速简便的初步鉴别HEV的型别,在应对HEV引起的突发疫情病原学诊断方面具有重要的意义;(2)有些PV毒株的VP1核苷酸序列126位存在突变,HpaⅡ内切酶可能无法进行酶切,提示我们这种PCR-RFLP可能不再完全适用于对以后的PV分离株进行型内鉴定;(3)通过对EV71进行全基因组序列测定和分析,初步判断2012年阜阳地区流行的EV71仍为C4亚型,未发生较大变异。