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中枢神经系统退行性疾病作为一类慢性疾病,以神经功能退行性改变为主要特征。髓鞘变性或破坏是这类疾病发病的相同特点,伴随少突胶质细胞(oligodendrocyte,OLs)的减少或者功能的缺失。少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cell,OPCs)能够分化成OLs,并且形成新的髓鞘。因此,研究OPCs的增殖机制为进一步治疗脱髓鞘疾病开拓了新思路。本研究分为以下三个部分:第一部分:星形胶质细胞通过Cx47促进少突胶质前体细胞增殖本部分实验通过建立OPCs与星形胶质细胞(Astrocyte,ASTs)的不同培养体系,利用光镜和胸腺嘧啶核苷类似物(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)观察OPCs的生长情况;应用二代测序结果分析在不同培养模式下出现的差异表达基因,并采用RT-PCR验证其结果的准确性。主要结果如下:1.光镜结果显示,OPCs与ASTs接触式培养组有更多新生细胞,并且随着时间延长,增殖能力更佳;EdU检测到直接接触式培养组中新生OPCs数目多于单独培养组和上清培养组(P<0.01)。2.基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析接触式培养组与单独培养组基因表达情况,发现两组间差异表达基因的功能主要属于生物过程、细胞组件和分子功能。3.在二代测序结果(RNA sequencing,RNA-seq)中,接触式培养组中Cx47的FPKM值明显高于单独培养组和上清培养组,并且RT-PCR和高通量转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)的增长趋势相同,证明二代测序结果准确可信。上述实验结果说明ASTs可能通过Cx47促进OPCs增殖。第二部分:Cx47通过SphK1/S1P促进少突胶质前体细胞增殖在接触式培养可通过Cx47促进OPCs增殖的基础上,进一步探讨不同培养条件下下游信号的变化。利用GO功能富集分析差异表达基因主要存在于细胞膜、胞外区及细胞外基质。通过对OPCs细胞膜上G蛋白偶联受体进行聚类分析,发现其主要表达三个亚型,分别是S1PR1、S1PR3和S1PR5,以S1PR3的差异性较单独培养组最为明显。S1P是S1PR3的特异激动剂。S1P既可以在细胞内发挥第二信使的作用,又可以分泌到细胞外与其特异性受体S1PRs结合,其生物学效应主要与细胞增殖、迁移和分化有关,并且受鞘氨醇激酶(sphingsosine kinase,SphKs)活性的调控。聚类分析发现不同培养条件下SphKs的表达明显变化,接触式培养中SphKs表达明显增加。高效液相色谱法检测显示SphKs与细胞上清中S1P表达量的关系。CCK-8、Ed U、流式细胞术(flow cytometry,FCM)和光镜检测S1P对OPCs的影响。抑制剂阻断S1PRs后,观察OPCs生长情况的改变。主要结果如下:1.结果显示接触式培养组中SphK1较单独培养组和上清培养组升高,而SphK2在这三组中无明显变化。2.高效液相色谱法检测S1P发现,使用了SphK1抑制剂组中S1P浓度低于对照组(P<0.01)。3.光镜和CCK-8均表明S1P能够促进OPCs增殖,其促增殖机制与细胞周期的改变有关(P<0.01)。4.FPKM值显示,接触式培养组中S1PR3的表达量高于单独培养组。5.抑制S1PR3后,新生OPCs数目降低(P<0.01);在S1PR3阻断剂组中加入S1P,则S1P促增殖能力减弱(P<0.01)。上述实验结果说明Cx47促进OPCs增殖机制可能与Sph K1/S1P的激活有关。第三部分:S1P/S1PR3激活少突胶质前体细胞下游PI3K/Akt通路促进其增殖上述实验证实了S1P可通过作用于OPCs表面特异性受体S1PR3,从而促进其增殖,但是受体与配体作用后下游信号通路又如何?本部分实验主要通过WB、FCM及EdU检测S1P/S1PR3下游信号通路的变化。主要结果如下:1.抑制剂阻断S1PR3后,PI3K(0.08±0.02)的表达量较对照组(0.14±0.04)降低;阻断PI3K后,虽然Akt的表达量无明显变化,但蛋白p-Akt(0.11±0.03)低于对照组(0.31±0.03)。2.抑制S1PR3后,OPCs新生细胞数目降低(P<0.01);细胞周期阻滞在G1期(P<0.01)。上述实验结果说明接触式共培养增加S1P与S1PR3的结合机率,从而激活下游PI3K/Akt信号途径促进OPCs增殖。