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研究目的:妊娠期糖尿病(gestational diabetesmellitus,GDM)通常被公认为是一个严重危害胎儿的妊娠并发症。GDM是孕期首次发生的糖代谢异常。最近的研究表明,巨大儿在妊娠期糖尿病引起的不良妊娠结局中有一个明显的上升趋势。在巨大儿的围产期,伴随着更多的窒息、产伤、低血糖、死亡等风险。此外,许多研究表明,GDM诱导产生的巨大儿在后期生长发育过程中有患糖尿病、肥胖和动脉粥样硬化等其他代谢紊乱的风险。研究发现,GDM患者在孕前存在诱导妊娠期糖尿病发生的高危因素,如孕前体重指数、年龄、孕次等,但是这些高危因素与GDM诱导巨大儿发生的关系,目前尚不清楚。因此,通过对巨大儿发生与孕前危险因素的关系进行研究,有助于在孕前对高危因素进行早期预防和控制。妊娠期糖尿病存在孕期的高血糖、高血脂及胰岛素抵抗等代谢异常,这些代谢异常状态,可以导致经由胎盘进入胎儿血液循环中的糖脂代谢发生异常,进一步引起胎儿宫内能量代谢过剩,以脂肪形式存在胎儿体内,导致胎儿体重明显增加,以致出现巨大儿。目前研究显示,在孕期,早期检测及早期控制血糖可控制GDM诱导的巨大儿发生。有趣的是,即使将GDM孕期血糖控制在正常血糖范围,巨大儿的发生率仍未明显下降,这提示GDM诱导发生巨大儿,不仅和母体血糖有关,还存在其他更重要的因素。GDM孕妇分娩的巨大儿具有围产期高风险及在后期生长发育过程中心脑血管疾病的高发风险等特点。脐血作为胎儿提供血液供应的场所,脐血脂糖代谢在一定程度上严重影响了胎儿发育过程,脐血血脂、血糖代谢异常,是GDM产儿围产期及后期合并症的发病基础。因此研究胎儿宫内的异常代谢状态至关重要,目前由于操作受限,孕期胎儿代谢情况,主要通过产科超声进行评估。羊水指数、脐带血流指标等关键指示性指标,是临床进行胎儿生长发育评估和评价的重要指标。脐血糖脂代谢指标的变化与巨大儿发生的关系的研究,可以为探明巨大儿发生的机制及巨大儿远期并发症的研究提供一个新的切入点。除了母体代谢因素外,胎盘组织是连接母体与胎儿宫内环境的桥梁,起到转运营养物质的作用。胎盘组织蛋白表达的高低,直接影响了营养物质的跨胎盘转运。因此对于胎盘组织部位蛋白的研究,可以为GDM诱导巨大儿发生的机制提供一个新的研究平台。研究发现,在妊娠期糖尿病胎盘组织中,介导糖脂代谢信号转导通路的关键蛋白-腺苷酸活化的蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)表达发生了 显著地变化。且在以往的研究中提出,AMPK激活后可介导下游糖代谢和脂代谢。但对于AMPK介导的信号通路是否在GDM诱导的巨大儿发生过程中的起到关键信号通路作用目前尚不清楚。本实验目的在于探讨GDM诱导产生巨大儿的糖脂代谢相关危险因素,并通过研究胎盘组织部位AMPK介导的糖脂代谢信号转导通路的变化,对GDM诱导巨大儿的高危因素和具体机制进行更进一步研究,可以为减少巨大儿的产生和妊娠糖尿病母亲婴儿相关并发症提供帮助。研究方法:本研究我们依据GDM和巨大儿的诊断标准分将孕妇分为GDM组和正常糖耐量组,将新生儿分为GDM巨大儿组(GDMM),GDM正常出生体重儿组(GDMN)和正常糖耐量正常出生体重儿组(CON)。孕妇在孕晚期做超声检查,检测羊水指数、双顶径、股骨长、脐带血流指标等指标来估测胎儿宫内发育情况和新生儿出生体重。在孕妇阴道分娩或剖宫产时收集两组产妇顺产或剖宫产脐动脉血,用湿化学方法测定脐血中血脂指标、血糖指标。同时进行胎盘组织的收集,实验中为了减少RNA和蛋白质的降解,要求在胎儿娩出后立即剪取约1cm3胎盘组织取胎儿面的胎盘组织,用冷水快速冲洗组织,然后放入标记的冷冻管保存在80℃,以进一步提取蛋白质和总RNA。Western blotting检测差异表达的腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信号通路相关蛋白的表达,包括磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated-AMPKα(Thr172),p-AMPKα(Thr172))、AMPKα、乙酰辅酶 A羧化酶(Acetyl CoA Carboxylase,ACC)、磷酸化的乙酰辅酶A羧化酶(phosphorylated-Acetyl-CoA carboxylase(Ser79),p-ACC(Ser79))、葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)在三组胎盘组织之间的差异性表达。胎盘组织ACC、GLUT1和AMPKα的mRNA水平用实时荧光定量PCR检测。临床数据和胎盘组织相关蛋白质和mRNA相对表达结果输出和分析用GraphPad Prism 5.0分析软件进行定量。计量资料以“均数±标准差”表示,GDM与NGT组两组间的临床数据的比较采用单样本t检验,三组间的胎盘mRNA和蛋白表达比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用SNK法。变量间相关性分析用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.孕妇一般特征(1)孕期基本特征:在孕中期,空腹血糖(FBG)GDM组水平比NGT组高1.06mmol/l,而血糖在孕晚期无统计学差异(P>0.05)。此外,GDM组与NGT组相比,孕妇的年龄、血压、产次均无统计学差异(P>0.05)。除此之外,GDM组存在糖尿病家族史4例,而NGT组中无糖尿病家族史。其中孕中期血糖与新生儿出生体重(NBW)呈正相关关系(P<0.05),孕晚期空腹血糖与NBW无明显相关性(P>0.05)。(2)孕前体重指数(Body mass index,BMI)和孕期增重:在孕期增重和孕前体重指数GDM组均明显高于NGT组(P<0.05)。且相关分析发现,NBW与孕妇孕前体重指数(BMI)和孕妇孕期增重均存在正的相关关系(P<0.05)。2.新生儿特点GDM组的新生儿出生体重(NBW)显著高于NGT组(P<0.05)。GDM组巨大儿发生率明显高于NGT组。同样,GDM组分娩的新生儿NBL平均值也明显升高(P<0,05);两组新生儿在胎龄、性别比例、胎盘重量、脐带长度等方面差异无统计学意义(P>0.05)。3.脐血糖脂代谢(1)脐血糖代谢:NGT组和GDM组两组胎儿脐血血糖无统计学差异(p>0.05)。且相关分析发现,脐血血糖与孕妇孕晚期血糖及新生儿出生体重均无明显的线性相关关系(p>0.05)。(2)脐血脂质代谢:GDM组较NGT组脐血HDL-C降低11.4%,ApoB/ApoA比值升高16%,两组间比较有显著性差异(P<0.05)。而两组间其他指标TC、TG、LDL-C、LP、ApoA和ApoB比较差异均无统计学意义(P>0.05)。4.胎儿孕晚期超声GDM组比NGT组羊水指数(AFI)高2.7,增加29.6%,差异有统计学意义(P<0.05)。其他指标:检查孕周(GA)、胎儿双顶径(BPD)、股骨长(FL)、S/D、RI和PI指标,两组间比较无统计学差异(P>0.05)。且相关分析发现,AFI与母体孕晚期血糖、新生儿出生体重均呈正相关关系(P<0.05)。5.胎盘组织蛋白表达(1)胎盘组织蛋白表达:GDM诱导的巨大儿胎盘组织中GLUT1和ACC蛋白高表达(P<0.05),而 p-AMPKα(Thr172)和 p-ACC(Ser79)低表达(P<0.05),AMPKα蛋白表达在三组之间无统计学差异(P>0.05)。且胎盘组织各蛋白与NBW进行相关分析发现,在GDM诱导的巨大儿胎盘组织中,GLUT1、ACC蛋白表达与 NBW 正相关,p-ACC(Ser79)和 p-AMPK(Thr172)与 NBW 负相关(P<0.05)。但新生儿出生体重与AMPKα无明显相关关系(P>0.05),ACC蛋白表达仅在GDMM组胎盘组织中发现与新生儿出生体重存在正相关关系(P<0.05),而在GDMN组中不存在此关系(P>0.05)。蛋白间相关分析显示:p-AMPK蛋白表达与p-ACC蛋白表达正相关(P<0.05),而与GLUT1蛋白表达无明显相关性(P>0.05)。(2)胎盘组织蛋白mRNA表达:GDM诱导的巨大儿胎盘组织GLUT1 mRNA高表达,AMPKα和ACC的mRNA低表达(P<0.05)。且相关分析发现,GDM诱导的巨大儿胎盘组织中GLUT1mRNA表达与NBW呈正相关,AMPKα和ACCmRNA与NBW呈负相关(P<0.05)。结论1.孕前肥胖、超重及孕期增重过高均为GDM诱导巨大儿发生的高危因素。除了孕期血糖外,孕前控制体重,孕期控制增重可以减少巨大儿发生。2.胎盘组织GLUT1蛋白表达升高,可增加糖转运过多进入胎儿循环中,引起GDM诱导巨大儿的发生。3.胎盘组织中p-ACC蛋白表达降低和ACC蛋白表达升高,可导致脂肪酸含量过量,引起GDM诱导产生巨大儿。4.AMPK介导的信号转导通路在GDM诱导产生巨大儿过程中,主要影响脂代谢,而非糖代谢。5.妊娠期糖尿病诱导产生的巨大儿在宫内生长发育过程中存在HDL-C,APoB/APoA等脂代谢异常,且巨大儿后期生长发育过程中具有发生糖脂代谢异常的高风险。