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目的:探讨迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)通过影响补体3/补体3 a受体(Complement 3/Complement 3a receptor,C3/C3a R)信号表达调控小胶质细胞激活和神经炎症反应对阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD)小鼠记忆障碍的作用及其药理机制。方法:(1)在体内实验中,采用SPF级3月龄Presenilin 1/2条件性双基因敲除(Presenilins conditional double knockout,PS c DKO)AD模式小鼠及其同窝野生型小鼠,雌雄各半,随机双盲分为同窝野生型组(Wildtype,WT,n=15)、野生型+迷迭香酸组(WT+RA,n=15)、PS c DKO组(c DKO,n=15)、PS c DKO+迷迭香酸组(c DKO+RA,n=15),WT组和PS c DKO组小鼠用正常饲料进行饲养,WT+RA组和PS c DKO+RA组小鼠用含有RA(100 ppm)的饲料进行饲养,RA治疗60 d后进行行为学检测(包括旷场实验、新异物体识别实验、Y迷宫、Morris水迷宫和条件性恐惧实验),共30 d,并持续给予RA治疗。行为学结束后采用离体脑片场电位记录技术,记录各组小鼠HPC谢弗侧枝CA1(Schafer collateral-CA1,SC-CA1)区突触传递和长时程增强(long-term potentiation,LTP)的变化。ELISA检测各组小鼠海马(hippocampus,HPC)中肿瘤坏死因子-α(tumor putrescence factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的含量。q RT-PCR测定各组小鼠HPC和前额皮质(prefrontal cortex,PFC)中补体C3、受体C3a R和促炎症因子一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、TNF-α、IL-1β、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的m RNA表达;Western blot测定各组小鼠HPC和PFC中补体C3、C3a R、i NOS、COX-2和相关突触蛋白N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)(NR1,NR2A,NR2B)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptor,AMPAR)(Glu R1,Glu R2)、突触后密度蛋白(postsynaptic density protein-95,PSD-95)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、突触素(synaptophysin,SYP)的表达。(2)在体外实验中,培养SD大鼠原代小胶质细胞,MTT实验检测不同浓度的RA(0.3μM-80μM)对于原代小胶质细胞活性的影响。采用Griess试剂检测不同浓度的RA(0.3μM-80μM)干预对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激原代小胶质细胞产生的一氧化氮(nitric oxide,NO)产物量的影响。原代小胶质细胞共分为四组:正常对照组(Control,Ctrl)、正常对照+迷迭香酸组(Ctrl+RA)、脂多糖组(LPS)和脂多糖+迷迭香酸组(LPS+RA),Western blot检测了6个时间点(2 h,4 h,6 h,12 h,16 h,24 h)的RA对LPS刺激小胶质细胞后C3a R蛋白表达及8个时间点(0.5 h,1 h,2 h,4 h,6 h,12 h,16 h,24 h)的RA对LPS刺激小胶质细胞后i NOS和COX-2蛋白表达的影响。慢病毒包装及转染C3a R干扰质粒,共分为7组:正常对照组(Control,Ctrl)、补体3组(Complement 3,C3),补体3+迷迭香酸组(C3+RA),补体3+干扰质粒组(C3+sh RNA),补体3+干扰质粒+迷迭香酸组(C3+sh RNA+RA),补体3+对照质粒组(C3+EV)和正常对照+对照质粒组(Ctrl+EV)。Western blot检测加入C3 24 h后C3a R和COX-2、i NOS的蛋白表达。结果:(1)在旷场实验中,RA没有改变PS c DKO小鼠的活动时间及活动距离,说明RA并不会影响PS c DKO小鼠的自发运动能力;新异物体识别实验显示在1 h测试中PS c DKO小鼠较WT小鼠花费更少的时间探索新物体,RA治疗后增加PS c DKO小鼠对新物体的偏好,说明RA可以改善PS c DKO小鼠的短期记忆受损;Y迷宫实验显示,PS c DKO小鼠较WT小鼠在闭合臂逗留的频率和时间均降低,而PS c DKO+RA小鼠在闭合臂逗留的频率和时间较PS c DKO小鼠均增加,说明RA能改善PS c DKO小鼠空间记忆能力。Morris水迷宫实验结果显示,PS c DKO小鼠的逃避潜伏期明显高于WT小鼠,RA治疗后显著降低了PS c DKO小鼠的逃避潜伏期;在去平台测试期间,PS c DKO小鼠在目标象限活动的距离和时间及穿越目标象限的次数与WT小鼠相比显著降低,RA治疗后PS c DKO小鼠在目标象限的活动偏好显著提高。说明RA改善PS c DKO小鼠的空间参考记忆障碍。条件性恐惧任务结果显示PS c DKO小鼠的僵直时间百分比明显低于WT小鼠,而PS c DKO小鼠接受RA治疗后僵直时间显著增高,说明RA改善PS c DKO小鼠的联合记忆障碍。(2)离体脑片的场电位记录结果表明,在不同的刺激强度下,四组小鼠的兴奋性突触后场电位(field excitatory postsynaptic potential,f EPSPs)斜率相似,表明PS c DKO小鼠在有或无RA治疗的情况下对SC-CA1的基础突触传递均没有产生影响。与WT小鼠相比,PS c DKO组小鼠中由高频刺激(high frequency stimulus,HFS)诱导引起的LTP明显降低。而RA治疗能够改善由HFS诱导引起的PS c DKO小鼠降低的LTP,表明RA治疗能够改善PS c DKO小鼠受损的突触可塑性。(3)Western blot结果显示PS c DKO小鼠较WT小鼠HPC和PFC中C3、C3a R及COX-2、i NOS的表达水平均显著增高,RA治疗后PS c DKO小鼠HPC和PFC中C3、C3a R及COX-2、i NOS的表达水平被逆转说明RA抑制PS c DKO小鼠HPC和PFC中补体C3、C3a R的表达及神经炎症反应。q RT-PCR结果显示RA显著降低PS c DKO小鼠HPC和PFC中促炎症因子COX-2、i NOS以及TNF-α、IL-1β、IL-6 m RNA表达;ELISA结果显示RA显著降低PS c DKO小鼠HPC中TNF-α和IL-1β的表达量。q RT-PCR和ELISA结果说明RA可以抑制PS c DKO小鼠的神经炎症反应。Western blot检测HPC和PFC突触蛋白的表达结果显示,PS c DKO小鼠较WT小鼠HPC和PFC中NMDARs(NR2A、NR2B、NR1)及突触功能相关的PSD-95、SYP、MAP2蛋白的表达水平显著降低,RA治疗后逆转了NMDARs及PSD-95、SYP、MAP2的低表达水平,但对AMPAR蛋白表达水平无影响。说明RA能够改善突触功能障碍及神经元突触损伤。(4)MTT实验结果显示,在有无LPS刺激的前提下,RA(0.3-80μM)对原代小胶质细胞的活性均无影响,说明RA对原代小胶质细胞无毒性作用。NO实验结果显示LPS刺激原代小胶质细胞后,RA(0.3-80μM)预处理明显降低细胞培养液中NO产物的生成量并且呈现出剂量依赖性。Western blot结果显示,Ctrl+RA组与Ctrl组相比,在6个时间点中均无明显差异,但在加入LPS 12 h后C3a R开始显著性表达,在24 h时C3a R表达量达到最高,加入RA干预后,C3a R表达量显著性降低。LPS刺激原代小胶质细胞24 h后相较于Ctrl组,COX-2和i NOS蛋白表达量显著提高,加RA(10μM)干预后COX-2和i NOS蛋白表达量显著降低。慢病毒转染后Western blot结果显示C3组相比与Ctrl组C3a R和COX-2、i NOS表达水平显著升高,加RA干预后C3a R和COX-2、i NOS表达被显著抑制。同时在C3+sh RNA组观察到与C3+sh RNA+RA组,C3+RA组相似的COX-2、i NOS表达水平,说明RA通过抑制C3a R降低了促炎因子COX-2和i NOS的表达。结论:(1)迷迭香酸可以通过抑制补体C3/C3a R的表达,下调HPC和PFC小胶质细胞激活导致的促炎症因子释放从而改善PS c DKO小鼠神经炎症反应。(2)迷迭香酸具有通过抑制神经炎症反应逆转PS c DKO小鼠HPC和PFC的突触可塑性损伤改善记忆障碍的作用。(3)离体实验证实迷迭香酸通过抑制补体C3/C3a R的表达改善LPS诱导的小胶质细胞的激活和炎症反应。