心肌纤维化（myocardial fibrosis,MF）是指由于多种病理因素导致正常的心肌组织中胶原纤维过量沉积,胶原纤维浓度和胶原纤维容积分数明显增加,各型胶原纤维比例失调以及结构排列紊乱。心肌成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度分泌、堆积是其主要原因,最终可导致心力衰竭。抑制成纤维细胞增殖和胶原纤维合成是抑制心肌纤维化的主要作用环节。心肌成纤维细胞占心脏容积总量的25%和心脏细胞总数的70%。另外,心肌成纤维细胞作为心肌组织中占绝大多数的非心肌细胞,它们参与了心肌纤维化、心室重构的过程。目前,研究证明心肌纤维化与肥厚型心肌病、高血压性心脏病、扩张性心肌病及缺血性心肌病等多种心血管疾病的发生、发展密切相关。心肌纤维化是慢性心力衰竭的病理基础,与心力衰竭的进展密切相关。流行病学调查显示,心衰已成为成人死亡的主要原因。因此,有关心衰的研究越来越受到人们的重视,关于心肌纤维化形成的机制,主要围绕以下3方面展开:1)胞外刺激因素的作用;2)细胞内信号转导通路的改变;3)产生影响细胞外基质沉积或成纤维细胞增殖的表达产物。脂肪组织具有储存能量和分泌内源性活性因子的功能。这些具有活性的因子被称为脂肪细胞因子,它们在血浆含量丰富并通过分泌到全身各器官广泛参与机体生命活动的调节,例如调节细胞分化生长、发育,影响能量代谢、参与炎症应答以及与心血管疾病的发生密切相关。现有的研究表明,脂肪因子中有越来越多的成员参与调节心肌重构的过程。Goralski等在2007年确认了趋化素是一种新的具有趋化作用的脂肪因子,在脂肪组织和肝脏组织中中高表达,同时,在肺、心脏、卵巢、肾脏等组织中也有少量表达,并且与脂肪细胞的生成、炎症反应的发生和能量代谢等病理生理活动有密切关系。到目前为止,我们所知的趋化素的生理作用都是通过其受体--CMKLR1来发挥的。目前,有研究发现趋化素与CMKLR1能够在细胞免疫反应中、血管内皮细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞等上发挥作用。研究发现,冠心病患者的心外膜脂肪中趋化素呈现高水平的表达,这样不仅不仅增加了心脏负荷,而且可能阻断胰岛素信号通路,进而影响能量代谢,同时与多种炎症因子间相互作用,促进心肌重构。心肌纤维化的发病机制有多种因素,其中肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活是心肌纤维化最主要的致病因素,而醛固酮则是独立于血管紧张素Ⅱ的心血管疾病的危险因素。越来越多的证据显示心脏成纤维细胞是醛固酮主要的效应细胞。慢性心力衰竭导致的死亡患者身上往往有较高的醛固酮水平。有实验发现,在培养的大鼠心脏成纤维细胞上,醛固酮可明显抑制醛固酮刺激的心脏成纤维细胞蛋白核酸合成速率的增高,该过程可被螺内酯阻断,提示醛固酮与心肌纤维化密切相关。Rho/ROCK（Rho-associated coiled-coil protein kinase）信号通路位于多种信号通路的上游,有“分子开关”的作用,它将胞质信号转入核内,从而调控相关的基因和蛋白表达。是多种组织细胞中普遍存在的一条信号转导通路。研究表明在心力衰竭过程中,Rho/ROCK通路中的Rho、ROCK的mRNA表达水平明显上调,提示Rho/ROCK信号通路在充血性心力衰竭的发生、发展过程中起重要作用。丝裂原活化蛋白激酶（Mmitogen activated protine kinase,MAPKs）信号通路是多种细胞外信号引起细胞增殖,分化与信号转导的共同通路与汇聚点。各种亚型在调控细胞功能时相互交错,通过核转位调节核内转录因子,作为细胞反应的主要传递者将细胞外有关信号传导到细胞核内部。在调控细胞生长、分化和凋亡等生理过程中发挥重要作用。研究表明醛固酮可通过MAPK途径促进心脏成纤维细胞增殖。现已认为MAPK的激活与心肌重构及心衰的发生发展关系密切。目前,有关趋化素在心脏成纤维细胞中的表达以及趋化素在醛固酮诱导心脏成纤维细胞纤维化过程中作用及其作用机制还不清楚;本研究通过观察醛固酮诱导心脏成纤维细胞心肌纤维化过程中趋化素表达的变化,并进一步探讨了Rho?ROCK?MAPK信号转导系统在醛固酮诱导SD乳鼠心脏成纤维细胞趋化素表达过程中可能发挥的作用及其作用机制。本研究主要包括以下三部分:第一部分趋化素在心脏成纤维细胞中的表达目的:观察SD大鼠乳鼠心脏成纤维细胞是否能够表达趋化素及其受体CMKLR1,并为下一步实验奠定基础。方法:1急性酶解法消化、分离鼠龄2-3天的SD乳鼠心肌细胞,培养、传代心脏成纤维细胞至第二、三代。2采用RT-PCR、Western-Blot、免疫细胞化学等分子生物学技术观察心脏成纤维细胞中趋化素及CMKLR1表达情况。结果:1 Real-Time PCR结果显示:SD乳鼠心脏成纤维细胞中有趋化素mRNA的表达。2 Western-Blot结果显示:SD乳鼠心脏成纤维细胞中有趋化素蛋白及受体CMKLR1的表达。结论:SD乳鼠心脏成纤维细胞中有趋化素及其受体CMKLR1的表达。第二部分醛固酮诱导心脏成纤维细胞趋化素表达的变化目的:观察醛固酮对心脏成纤维细胞趋化素表达的影响。方法:1急性酶解法消化、分离鼠龄2-3天的SD乳鼠心肌细胞,培养、传代心脏成纤维细胞至第二、三代,之后应用不同浓度的醛固酮、在不同的时间点干预心脏成纤维细胞。2应用RT-PCR、Western-Blot技术检测心脏成纤维细胞中趋化素mRNA和蛋白表达情况的变化,应用Western-Blot、RT-PCR技术检测心脏成纤维细胞TGF-β、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白ⅢmRNA和蛋白表达情况的变化。结果:1在醛固酮的干预下,心脏成纤维细胞趋化素表达随着醛固酮干预浓度和干预时间的延长而显著增加。在mRNA和蛋白水平,趋化素在醛固酮10^-7 mo1/L干预24 h后达到最高值（P<0.05）。2在醛固酮的干预下,心脏成纤维细胞TGF-β蛋白水平,在醛固酮10^-8 mo1/L干预24 h后达到最高值（P<0.05）。3在醛固酮的干预下,心脏成纤维细胞胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ蛋白水平随醛固酮浓度的升高和干预时间的延长而增加,胶原蛋白Ⅰ/胶原蛋白Ⅲ的蛋白表达水平之比明显升高,在醛固酮10^-7 mo1/L干预24 h后达到最高值（P<0.05）。结论:1在醛固酮诱导心脏成纤维细胞过程中,醛固酮可以浓度和时间依赖性的增加成纤维细胞趋化素、TGF-β的MRNA和蛋白表达水平。2在醛固酮诱导心脏成纤维细胞过程中,醛固酮可以浓度和时间依赖性的增加成纤维细胞胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的蛋白表达水平以及胶原蛋白Ⅰ/胶原蛋白Ⅲ的比率水平。第三部分Rho/ROCK、MAPK信号转导通路对醛固酮诱导心脏成纤维细胞中趋化素表达的调节目的:探讨Rho/ROCK、MAPK信号转导通路对醛固酮诱导心脏成纤维细胞中趋化素表达的调节。方法:1急性酶解法消化、分离鼠龄2-3天的SD乳鼠心肌细胞,培养、传代心脏成纤维细胞至第二、三代。2用醛固酮(10^-7 mmol/L,24 h)干预心脏成纤维细胞,诱导心肌纤维化,同时观察Rho/ROCK通路阻断剂Y27632,对对照组、醛固酮组、醛固酮+Y27632组,Y27632组心脏成纤维细胞中chemerin蛋白表达水平的影响。3用醛固酮(10^-7 mmol/L,24 h)干预心脏成纤维细胞,诱导心肌纤维化,同时观察醛固酮受体阻断剂螺内酯对对照组、醛固酮组、醛固酮+螺内酯组、螺内酯组中心脏成纤维细胞p-MYPT1及总MYPT1蛋白表达水平的影响。4用醛固酮(10^-7 mmol/L,24 h)干预心脏成纤维细胞,诱导心肌纤维化,分别应用SB203580、PD98059及SP600125阻断p38 MAPK、ERK1/2、JNK通路,观察心脏成纤维细胞趋化素的蛋白表达水平的变化。5用醛固酮(10^-7 mmol/L,24 h)干预心脏成纤维细胞,诱导心肌纤维化,同时应用ROCK抑制剂Y27632作用于心脏成纤维细胞,观察Y27632对对照组、醛固酮组、醛固酮+Y27632组、Y27632组成纤维细胞p-JNK及总JNK蛋白表达水平的影响。应用Real time-PCR、Western-Blot技术检测心脏成纤维细胞趋化素MRNA和蛋白质的表达,Western-Blot技术检测p-MYPT1,总MYPT1,p-JNK和总JNK蛋白的表达情况。结果:1用Y27632干预心脏成纤维细胞后,心脏成纤维细胞趋化素的mRNA及蛋白表达水平较醛固酮干预组相比均明显降低（P<0.05）。2应用醛固酮干预心脏成纤维细胞后,总MYPT1及总JNK蛋白表达水平无明显变化,但是,p-MYPT1和p-JNK蛋白表达水平明显增加,p-MYPT1/总MYPT1以及p-JNK/总JNK表达水平增加。应用醛固酮受体阻断剂螺内酯干预24小时后,p-MYPT1?总MYPT1水平明显降低（P<0.05）。用Y27632干预心脏成纤维细胞后,p-JNK/总JNK表达水平明显降低（P<0.05）。3应用SB203580,PD98059及SP600125分别阻断p38MAPK、ERK1/2和JNK,与醛固酮组相比,醛固酮+SB203580组、醛固酮+PD98059组趋化素水平无明显变化,但是,醛固酮+SP600125组趋化素蛋白水平明显降低（P<0.05）。结论:Rho/ROCK通路在醛固酮诱导心脏成纤维细胞趋化素表达增加的过程中是必要的信号通路,Rho/ROCK信号传导通路与其下游的MAPK通路有交互作用,JNK通路在趋化素表达增加的过程中是Rho/ROCK的下游通路。