木霉Trichodermaguizhouense NJAU 4742是由本课题组分离筛选并进行商业化应用(生物有机肥)的重要菌株。在盆栽和大田实验条件下,该菌株均表现出优异的植物促生和生防土传真菌病害的功效。围绕其开展的一系列研究工作不仅具有科学参考价值,而且具有重要的实际指导意义。Hydrophobin(简写为HFB),是一类丝状真菌特有的具有高度表面活性的双亲小分子蛋白,其同时拥有疏水结构域和亲水结构域,可以自组装式地在疏水-亲水界面形成单分子蛋白膜,这对真菌自身生长及与周围环境或宿主互作都具有重要生物学意义。本研究首先对该菌株进行了盆栽和大田实验以验证其植物促生效应和根际定殖能力;然后利用基因转录分析、酵母异源表达、基因敲除和超表达等方法,在基因和蛋白水平上探究了木霉NJAU 4742菌株hfb家族基因的特性,主要结果如下:1.在盆栽和田间试验条件下,NJAU 4742菌株可有效定殖于根际,并促进番茄苗生长,与不接菌对照组相比生物量提高20%以上,田间产量提高10%。通过HPLC、LC/MS、GC/MS、NMR等手段从该菌株发酵液中分离纯化获得一促生活性物质——Harzianolide,可显著促进番茄根系生长和根尖分化,可能是NJAU 4742促生作用的重要机理之一。2.通过基因挖掘技术,从NJAU 4742菌株基因组中发现10个hfb基因,并较为完整地绘制了木霉HFB小蛋白家族的系统发育进化树,整理和命名了 16个HFB蛋白(hfb基因),首次发现并命名7个新的HFB蛋白(hfb基因,分别是hfb8、hfb10、hfb11、hfb12、hfb14、hfb15、hfb16)。同时,对NJAU4742菌株(培养基内)营养菌丝和(培养基上)气生菌丝的HFB家族全员转录响应分析(HFBome)表明,hfb4、hfb10、hfb8和hfb3为两种菌丝形态阶段的主要表达基因,hfb4为孢子形态阶段的唯一(hfb家族)表达基因;并发现,与植物体共培养并不能显著影响hfb基因转录水平的变化,hfb4除外——hfb4的转录水平在木霉与植物体共培养时显著降低,猜想HFB4极有可能参与了木霉与宿主植物识别、互作等重要过程,猜想在后文得到证实。3.利用毕赤酵母(Pichiapastories)胞外表达系统,高效表达了三个具有表面活性的HFB小蛋白(基因来自木霉):HFB4、HFB8和HFB15及其带蓝绿色和粉色荧光标记的HFB4::GFPuv和HFB8::mRFP融合蛋白,为后续跟踪定位HFB分布、转移提供了可能;且发现HFB蛋白可有效附着于人工材料如玻璃珠和生物体材料如植株根系,证明HFB蛋白参与木霉定殖根表过程。4.将PEG介导的木霉菌原生质体转化技术与部分重叠PCR技术(overlapping-PCR)及真菌菌落PCR技术相结合,对哈茨木霉基因编辑技术进行改进,成功地在1个月内完成基因敲除与突变子纯化等全部必要操作;分别获得T.guizhouense NJAU 4742及哈茨木霉国际标准株T.harzianum CBS 226.95的hfb4敲除株4株和3株,hfb4超表达株各3株。同时,对相关超表达株的hfb4基因拷贝数进行了 qPCR鉴定,验证各超表达菌株均含2拷贝hfb4(野生型为1拷贝)。5.通过对NJAU 4742及其姐妹菌株T.harzianum CBS 226.95的hfb4突变子进行表型研究,明确hfb4的基因功能:HFB4是T.guizhouense NJAU 4742菌株HFB家族中最为主要和关键的成员之一,证明其直接参与了真菌通过分泌HFB蛋白降低液体表面张力以长出气生菌丝的过程;并在气生菌丝生长阶段与HFB3、HFB8和HFB10一同为菌丝提供支撑、保护和粘附作用,直至产孢;最后在孢子表面形成HFB4蛋白膜,以增加孢子表面疏水性,帮助孢子通过风媒传播。同时,HFB4可帮助木霉菌抵御杀真菌剂(氟康唑)和氧化剂(甲萘醌)的侵害,其包裹在细胞表面增加细胞表面疏水性,产生类似“雨衣”的效应,极有可能是木霉菌抵御外界不良环境因子及氧自由基的重要分子,而对两性霉素B起到“锚定”作用,增加其对细胞的毒害;另外,HFB4也是NJAU 4742菌株应对机械损伤的响应蛋白,在受到机械损伤时hfb4转录水平显著上调,基因敲除后,相关反应“迟钝”。然而,相关表型在T.harzianum中相反,这主要是由于菌株间hb家族成员的内部调控差异造成的。在姐妹菌株T.harzianum CBS 226.95中,HFB4的功能极有可能被HFB10取代,T.harzianum的孢子表面疏水性主要来源于hfb10的表达,hfb4的敲除不产生显著影响。此外,HFB4还参与了木霉菌-植物-病原真菌的互作过程,其可调节菌丝表面的亲疏水性(粘附性)。综上,Trichoderma guizhouense NJAU 4742是一株高效的植物促生菌,其促生机理之一是分泌类植物激素Harzianolide促进作物根系生长;其可有效定殖根表的原因之一拥有数量众多的表面活性小蛋白HFB;主要表达基因hfb4参与了木霉菌气生菌丝形成、菌丝和孢子表面疏水性能维持、孢子风媒传播、机械损伤反应、逆境抵御及病原真菌拮抗等一系列过程。