【摘 要】
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粘虫Mythimna separata(Walker)是一种迁飞性、多食性、暴发性的世界性害虫,其已对多种杀虫剂产生了抗性。本文以玉米粘虫为研究对象,经过氯虫苯甲酰胺或氟虫腈处理粘虫3龄幼虫24 h后,构建转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq测序,运用实时荧光定量PCR(qPCR)筛选出不同条件下最佳的内参基因及差异性表达的P450基因,并通过RNA干扰(RNAi)技术确定对杀虫剂
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粘虫Mythimna separata（Walker）是一种迁飞性、多食性、暴发性的世界性害虫,其已对多种杀虫剂产生了抗性。本文以玉米粘虫为研究对象,经过氯虫苯甲酰胺或氟虫腈处理粘虫3龄幼虫24 h后,构建转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq测序,运用实时荧光定量PCR（qPCR）筛选出不同条件下最佳的内参基因及差异性表达的P450基因,并通过RNA干扰（RNAi）技术确定对杀虫剂具有解毒代谢功能的主效P450基因。具体研究结果如下:1.采用叶片浸渍法测定氯虫苯甲酰胺或氟虫腈对粘虫的毒力。结果表明氯虫苯甲酰胺或氟虫腈对粘虫3龄幼虫致死中浓度LC50分别为0.45和18.72 mg/L,对粘虫3龄幼虫的10%致死浓度LC10分别为0.15和13.66 mg/L。2.分别用氯虫苯甲酰胺(LC10)或氟虫腈(LC10)处理粘虫3龄幼虫24 h后,通过构建转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq测序。结果表明,氯虫苯甲酰胺处理粘虫后,共有29个P450基因表达量上调,27个P450基因表达量下调;氟虫腈处理粘虫后,共有23个P450基因表达量上调,26个P450基因表达量下调。3.在转录组测序文库中筛选出8个常用的内参基因includingβ-actin（β-ACT）、18s ribosomal（18S）、28s ribosomal（28S）、glyceraldehyde-3-phosphate（GAPDH）、elongation fator-alpha（EF1-α）、TATA box binding protein（TBP）、ribosomal protein L7（RPL7）、alpha-tubulin（α-TUB）,用qPCR方法,并通过△Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper程序,筛选出适合不同实验条件的稳定内参基因。对于发育阶段,28S和RPL7是最适合内参基因;对于不同组织,RPL7和EF1-α是最合适内参基因;而对于杀虫剂处理,28S和α-TUB是最适合内参基因。4.从粘虫转录组文库中筛选出受氯虫苯甲酰胺或氟虫腈影响的12个P450基因,运用荧光定量PCR技术验证P450基因的差异性表达。结果发现,氯虫苯甲酰胺处理后,CYP321A10、CYP4M6v2、CYP18A1-1、CYP301A1-2、CYP6B1-1、CYP333A1-1和CYP6B1-2这7个P450基因表达水平显著升高,分别为对照的2.22、2.54、2.87、3.62、3.86、4.35和5.63倍;CYP6B42、CYP6B6v2、CYP6AB32、CYP6AN1和CYP9A11这5个P450基因表达水平较对照显著下调,分别为对照的3%、9%、18%、26%和28%。氟虫腈处理后,CYP6B1-2、CYP18A1-1、CYP6B1-1和CYP301A1-2这4个P450基因表达水平较对照显著上调,分别是对照的1.75、2.38、2.63和4.57倍;CYP9A11、CYP6AB32、CYP6B6v2、CYP6AN1和CYP6B42这5个P450基因表达水平较对照显著下调,分别为对照的10%、13%、19%、21%和63%;CYP321A10、CYP4M6v2和CYP333A1-1这3个基因表达水平变化不显著。5.运用RNAi技术沉默CYP18A1-1、CYP6B1-1、CYP6B1-2和CYP301A1-2这4个P450基因,结果发现分别饲喂4种dsRNA 48 h后,CYP18A1-1、CYP6B1-1、CYP6B1-2和CYP301A1-2的沉默效率分别为46%、54%、63%和53%;饲喂dsRNA 24 h,向饲料中加入LC10的氯虫苯甲酰胺,继续饲喂24 h,检测沉默这4种P450基因对氯虫苯甲酰胺的敏感度变化,发现饲喂dsCYP18A1-1、dsCYP6B1-1、dsCYP6B1-2和dsCYP301A1-2的死亡率分别是对照组（dsGFP）的1.71、1.86、2.43和2.00倍。
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