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浙江玫瑰醋是一种复杂微生物参与的传统发酵食品。利用PCR-DGGE技术研究传统发酵食品中的微生物多样性,不仅能够获得群落中优势种类信息,而且能够同时分析多个样品,从而获得发酵过程中复杂的微生物群落演变规律。本文通过提取玫瑰醋样品中的基因组DNA作为模板,对细菌的16S rDNA V3区和真菌18S rDNA进行扩增,再将PCR产物用变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分析,通过对DGGE图谱的统计分析和16S rDNA序列分析研究浙江玫瑰醋中微生物群落结构的组成和演变规律。对玫瑰醋样品中基因组DNA的提取方法进行了探索,通过比较发现传统的CTAB法比试剂盒法更适合食醋中基因组DNA的提取,容易得到高浓度的DNA,较真实的反映了浙江玫瑰醋中的微生物群落结构和组成。对PCR扩增的引物和反应程序进行优化,结果表明:(1)带有“GC发夹”结构的PCR产物在DGGE分析时能得到较好的分离效果,而不带有“GC发夹”的PCR产物在DGGE胶中由于具有相似的电泳行为不能被分离;(2)降落PCR与普通PCR相比,前者的PCR产物在数量和特异性方面都较后者好。利用DGGE垂直胶确定了细菌和真菌DGGE水平电泳的最佳变性梯度,分别为35%～55%和30%～50%。利用时间进程法确定了DGGE水平电泳的最佳电泳时间为4h。对不同发酵时间的浙江玫瑰醋样品中的基因组DNA进行PCR扩增,获得的PCR产物进行DGGE电泳分析,细菌和真菌在DGGE中的分散度都非常好,细菌DGGE指纹图谱中有10个明显的主要条带,真菌DGGE指纹图谱中有7个较明显的主要条带。将从玫瑰醋中分离纯化得到的细菌与不同发酵阶段混合菌群的DGGE指纹图谱进行条带匹配分析,发现条带A与细菌An的条带发生匹配,在DGGE胶中具有相同的电泳行为,经16S rDNA序列分析鉴定为巴氏醋杆菌。对DGGE胶中的其它8个条带进行回收,并通过序列分析建立文库。再将获得的16S rDNA序列登陆NCBI与已知序列进行比对,得到6个发酵过程中的优势细菌,其中醋酸菌2种,分别是巴氏醋杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌;乳酸菌5种,分别是肠膜明串珠菌肠膜亚种、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌。真菌条带的DNA序列由于存在特殊结构无法进行分析,尚在鉴定中。将16S rDNA的序列分析结果与DGGE指纹图谱相结合,进一步阐明了浙江玫瑰醋整个发酵阶段的微生物群落演变规律。整个发酵过程微生物群落结构由复杂变为简单,并且发花阶段和发酵阶段的微生物群落结构有较明显的差异。发花阶段鉴定到的细菌有肠膜明串珠菌肠膜亚种、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌4种;发酵阶段鉴定到的细菌有巴氏醋杆菌、氧化葡萄糖酸杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌。肠膜明串珠菌肠膜亚种只在发酵第9天和第11天的样品中检测到。罗伊氏乳杆菌在发酵第13天至49天的样品中检测到,且条带的亮度随发酵的进行逐渐减弱。干酪乳杆菌只在发酵第13天的样品中被检测到。嗜酸乳杆菌在发酵第18天至33天的样品中检测到较亮的条带,随后条带的亮度减弱甚至消失。氧化葡萄糖酸杆菌在发酵第129天后的样品中均检测到较亮的条带,说明此菌种在发酵129天后才迅速生长繁殖成为优势菌种。巴氏醋杆菌在发花阶段快结束时才开始生长繁殖。罗伊氏乳杆菌对应的条带在第49天后的样品中均未检测到。而保加利亚乳杆菌和巴氏醋杆菌在所有样品中均检测到较亮的条带,即在整个发酵过程中始终保持优势地位。浙江玫瑰醋发酵成熟时细菌群落组成为保加利亚乳杆菌、巴氏醋杆菌和葡萄糖酸杆菌。