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目的:CD4~+CD25~+Treg细胞是体内的一种能够分泌多种细胞因子(IL-4、IL-10、TGF-β)、对效应性T细胞具有抑制作用的一种调节性T细胞。最初,人们发现它在自身免疫性疾病的发生、发展过程中发挥了重要的作用。随着对CD4~+CD25~+Treg细胞研究的逐渐深入,其在肿瘤发生和肿瘤细胞免疫逃逸中的作用越来越受到关注。有研究表明对抗CD4~+CD25~+Treg细胞可以引发机体抗肿瘤免疫反应。但目前对CD4~+CD25~+Treg细胞在胃癌肿瘤免疫抑制中的机制尚不清楚。本研究拟通过采用正向强化或反向阻抑CD4~+CD25~+Treg的方法,探索加强或阻抗CD4~+CD25~+Treg细胞活性后,机体抗胃癌的主要效应细胞CD8+CTL细胞和NK细胞抗胃癌活性的变化,以及与杀瘤效应有关的因子IFN-γ、穿孔素及Fas-L的改变;并通过分隔培养系统,观察CD4~+CD25~+Treg细胞抑制CD8+CTL细胞和NK细胞活性的效应并分析其可能机制,进一步探讨CD4~+CD25~+Treg细胞的抑制效应是否存在着特异性,以期为临床进行以CD4~+CD25~+Treg细胞为基础的抗肿瘤免疫调节生物治疗提供实验依据。方法:1、采用T细胞纯化柱分选脾细胞悬液中的T淋巴细胞,以免疫磁珠法(MACS)分选纯化CD4~+CD25~+Treg细胞。同时,选择GITR、FOXp3作为分选纯度鉴定的表面标志物,通过FACS测定分选目标细胞的GITR、FOXp3阳性表达率,鉴定分选目标细胞纯度,探索CD4~+CD25~+Treg细胞分离纯化的高效方法。2、通过小鼠前胃癌细胞MFC在小鼠腹腔接种,构建小鼠胃癌模型,观察小鼠CD4~+CD25~+Treg的变化,同时向该荷瘤小鼠注射CD4~+CD25~+Treg细胞或其功能抑制剂Anti-GITR,强化或阻抑荷瘤小鼠CD4~+CD25~+Treg细胞功能,通过检测小鼠胃癌细胞凋亡改变,观察CD4~+CD25~+Treg细胞对小鼠胃癌的影响。通过切除小鼠胸腺,观察其CD4~+CD25~+Treg细胞功能与数量的变化,了解胸腺在“胸腺-CD4~+CD25~+Treg细胞输出-抗肿瘤活性”中的作用。3、通过TransWell分隔培养和混合培养的方式,向CTL细胞、NK细胞与MFC胃癌细胞组成的体外抗胃癌作用体系中加入CD4~+CD25~+Treg细胞及相关的细胞因子拮抗剂,观察CTL及NK细胞对MFC胃癌细胞的杀伤情况,探讨CD4~+CD25~+Treg细胞抑制CTL细胞和NK细胞杀伤MFC胃癌细胞的可能机制及特异性抑制效应。结果:1、经T细胞纯化柱分选纯化T淋巴细胞,分选目标细胞的纯度和得率高、