目的:原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是儿童最常见的肾小球疾病,以大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症和浮肿为主要临床特征。约80%的PNS患儿对糖皮质激素正规治疗敏感,预后良好,即激素敏感型肾病综合征(steroid sensitive nephrotic syndrome,SSNS),但这其中仍有30%～40%的SSNS患儿临床表现为激素依赖或频复发(steroid-dependent nephrotic syndrome, SDNS/ frequent relapses nephrotic syndrome , FRNS)。此外约10%～20%的PNS患儿对糖皮质激素耐药,这其中有很多逐渐进展至终末期肾脏疾病(end-stage renal disease, ESRD)。近年来随着分子生物学的进展,越来越多的研究证实NPHS2基因突变可导致常染色体隐性遗传家族性和散发性激素耐药型肾病综合征(steroid resistant nephrotic syndrome,SRNS)。WT1基因突变可引起孤立性SRNS、Denys-Drash综合征(DDS)和Frasier综合征(FS)等肾脏疾病。目前,国际上有多个机构对散发性SRNS儿童进行了NPHS2或WT1基因突变分析的研究报告,而同时对于SDNS/FRNS患儿是否存在NPHS2基因突变及与SDNS/FRNS的关系仍有争议。我国对NPHS2和WT1基因突变分析的研究主要集中在北京、上海、福州及广州等地。为了解我国西南地区NPHS2和WT1基因变异的情况,本研究回顾性分析难治性肾病综合征患儿的临床资料,并对其进行NPHS2、WT1外显子8和9的基因分析及蛋白表达,旨在通过检测NPHS2和WT1基因突变特点及蛋白表达情况,以探讨难治性肾病综合征的NPHS2和WT1基因变异,为难治性肾病综合征的分子诊断提供理论依据,并制定合理的治疗方案。方法:回顾性分析中国西南地区汉族的25例难治性肾病综合征患儿的病例资料(包括性别、发病年龄、病程、尿常规、血生化、肾脏彩超、肾脏病理及治疗方案等临床数据)。采集患儿外周血,提取基因组DNA,采用PCR方法分别扩增NPHS2基因、WT1基因外显子8和9,PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,进行直接测序,使用DNAman软件将所得结果与美国国立生物技术信息中心(NCBI)的基因数据库进行比对。部分患儿的肾脏组织石蜡切片采用免疫组化检测podocin、wt1蛋白在肾组织表达的情况。结果:1、1例患儿的NPHS2基因外显子2检测到288C>T(S96S)的杂合同义突变和365G>C(W121S)的杂合错义突变,查阅相关文献报道,推测365 G>C可能是一个新的致病突变基因,288C>A可能是一个新的单核苷酸多态性(SNP)。且该患儿Podocin蛋白在肾组织没有表达。2、其余24例患儿中有6例激素耐药型肾病综合征患儿及2例频复发患儿检测出NPHS2基因的2个单核苷酸多态性(SNP),分别为954C>T,1038A>G,均为已报道的SNP,这两个位点基因的最小等位频率(MAF)分别为0.20和0.08,3、携带SNP患儿与未携带SNP患儿其临床特征无显著性差异(P>0.05)。4、所有患儿均未检测到WT1基因变异,行免疫组化检查的患儿其肾组织亦可见WT1蛋白表达;结论:1、本研究在1例激素耐药型肾病综合征患儿的NPHS2基因编码区检测到一个杂合错义突变(W121S)和一个同义突变(S96S),且该患儿肾组织中podocin蛋白无表达,推测该例患者发病和激素治疗反应差可能与NPHS2突变有关。2、中国西南地区汉族儿童存在NPHS2基因的954C>T,1038A>G两个SNP位点,其最小等位频率分别为0.20和0.08。基因多态性的改变均不影响Podocin蛋白的表达,亦不影响临床表现;3、本研究未检测到WT1基因突变及WT1蛋白表达异常,考虑WT1基因变异不是中国西南地区儿童难治性肾病综合征发病的主要遗传致病基因。