在显花植物授粉受精过程中，具顶端极性生长特性的花粉管是雄性生殖单位的载体，也是研究细胞生长分子调控机理的理想体系。与被子植物相比，裸子植物具有生长周期长，花粉管生长缓慢、易分叉等特点，具有不同于被子植物花粉发育的独特发育模式。对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的调控机理，目前尚不十分清楚。本文以松类植物中比较有代表性的裸子植物青杆(Picea willsonii)花粉为试材，构建青杆花粉和花粉管的cDNA文库，并通过RT-PCR方法克隆到微管蛋白基因TUA1，从Ca2+诱导青杆花粉cDNA文库中分离得到CCAAT框结合蛋白类型的转录因子基因HAP5。对这两个基因进行表达分析和功能鉴定，结果如下： 1.利用Clontech SmartTM cDNA Library Construction Kit构建青杆花粉及花粉管的cDNA文库，根据同源序列设计兼并引物，通过RT-PCR的方法获得微管蛋白基因TUA1的中间片段，经5-和3-RACE PCR，得到其全长cDNA，为1721bp，编码区全长为1353bp，编码含451个氨基酸的多肽，分子量为49.58kDa。在Ca2+诱导的青杆花粉cDNA文库中筛选得到基因PwHA.P5，该基因编码一个CCAAT框结合蛋白类型的转录因子，cDNA全长为985bp，编码区全长为603bp，编码含201个氨基酸的多肽，分子量为22.44kDa。 2.同源序列比较发现，青杆的微管蛋白基因TUA1与拟南芥、水稻、棉花和花旗松的微管蛋白有高度的序列同源性，分别为88.47％、96.9％、97.78％和99.78％。聚类分析表明PwTUAl属于I类α微管蛋白。青杆的转录因子PwHAP5与拟南芥、水稻、酵母和人类HAP5的关键结构域都比较保守，与拟南芥的AtNF-YC9(AtHAP5C)和水稻的OsHAP5A/B亲缘关系较近。 3.半定量RT-PCR分析表明PwTUA1在青杆花粉中特异表达，且表达水平随着花粉萌发过程逐渐升高，12小时达最高值，随后逐渐下降，并且在花粉萌发的各阶段均受到Ca2+和硼的诱导。PwHAP5在青杆花粉、针叶、茎和根中均有表达，随着花粉萌发时间延长，表达量逐渐升高，18小时达峰值后一直保持不变，在不同萌发时段PwHAP5表达均受Ca2+的诱导。 4.在青杆花粉中超表达PwTUA1可以提高花粉的萌发率和花粉管的生长速度，而超表达PwHAP5可以改变花粉管生长方向。 5.在拟南芥中组成型超表达PwTUA1使得转基因植株生长迟缓，出现螺旋生长，甚至由于不能够完成形态建成而死亡。在拟南芥花粉中专一表达PwTUA1可以促进花粉的萌发和花粉管生长，即使是在Ca2+和硼浓度非最适培养基中同样可以起到促进作用，并且PwTUA1在拟南芥花粉中的表达改变了TUA蛋白(微管蛋白α亚基)在花粉管中的分布模式以及花粉管的超微结构。野生型拟南芥中TUA蛋白主要定位于除花粉管尖端区域以外的整个花粉管中，而在转基因拟南芥花粉管的顶端区域有大量的TUA蛋白存在。野生型拟南芥花粉管壁远远厚于转基因拟南芥，在转基因拟南芥花粉管顶端存在许多短的游离的胞质微管，并且富集小泡，而在野生型拟南芥花粉管的相应位置中没有发现这些结构。 6.在拟南芥中超表达PwHAP5后，会影响果荚的排列，但不影响花粉管的生长方向。用青杆转录因子PwHAP5的N末端77个氨基酸、C末端130个氨基酸及全长分别做诱饵筛选青杆花粉和花粉管cDNA文库，共得到约80个克隆，经重新验证活性后，选择结合活性较强的克隆测序。在测序结果中筛选到7个与PwHAP5全长、N端和C端均相互作用的克隆。GenBanK中Blast结果发现这些克隆与拟南芥基因组中的同类基因有较高同源性。选择其中的PwFKBP12蛋白与PwHAP5通过双分子荧光互补实验进行体内互作的验证。