目的:近年来,随着剖宫产率的上升,胎盘植入发病率明显升高。胎盘植入患者易导致产时及产后大出血,是现代产科导致产妇和新生儿不良妊娠结局的原因之一。然而,胎盘植入的具体发病机制至今仍不明确,对胎盘植入发病机制的深入研究,将会为高风险人群的早期诊疗提供重要的理论依据。MicroRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA分子,通过与靶基因mRNA的3’末端非编码区结合来抑制基因表达。胎盘中表达多种miRNA,它们参与胎盘的发育过程,其异常表达与妊娠期相关并发症密切相关,如子痫前期重度、流产、胎儿生长受限和妊娠期糖尿病等。随着基因芯片和深度测序技术的发展,转录组测序可用于研究与发育和功能至关重要的特定基因以帮助理解和识别正常妊娠和病理妊娠的机制。miRNA表达谱和转录组联合分析,可系统性双层次联合研究miRNA调控基因表达的分子机制,关于胎盘植入的miRNA表达谱与转录组联合分析,目前尚无报道。在生理环境中,miR-193a-3p能够限制正常细胞的增殖和细胞周期进程,但作为miR-193家族的一员,其在不同疾病中的作用机制,尚存在争议。MiR-193a-3p在多种肿瘤中低表达,如肝细胞癌、胃癌、大肠癌、非小细胞肺癌等,相反的,miR-193a-3p在肾细胞癌和食管鳞状细胞癌中表达显著上调。MiR-193a-3p可通过靶向调节与增殖、凋亡、迁移、侵袭和转移相关的不同基因在癌症中发挥肿瘤抑制或促进作用。除此之外,MiR-193a-3p还可调节骨关节炎患者软骨基质的降解、减弱阿尔兹海默症患者神经毒性及保护脐静脉内皮细胞免受低氧损伤等功能,但miR-193a-3p在胎盘植入中的表达和作用目前尚未见报道。肝配蛋白及其受体是最大的酪氨酸激酶受体家族,包括8个配体和14个受体。已有研究证实,肝配蛋白及其受体在胎盘发育过程中发挥了重要的作用,且EphrinB2(EFNB2)在胎盘发育时存在时空性表达变化,可以在体外抑制内皮祖细胞介导的血管生成过程,但是,仅有少数研究探讨了EFNB2在滋养细胞侵袭中的作用。因此,本研究通过凶险性前置胎盘伴植入与非植入患者胎盘的miRNAs表达谱与转录组分析,探讨miRNAs在胎盘植入中的作用,且重点研究了miR-193a-3p通过调控EFNB2对胎盘植入的影响及其机制。研究方法:1.选取2016年6月-2017年10月于中国医科大学附属盛京医院诊断并分娩的凶险性前置胎盘患者10例,术前72小时内进行产前超声检查(二维+三维彩色多普勒+三维能量多普勒),采集胎盘组织标本,进行小RNA测序,筛选差异的miRNAs,并进行生物信息学分析。2.10例凶险性前置胎盘患者的胎盘组织标本进行转录组测序,筛选差异表达的mRNAs,并应用生物信息学方法联合分析miRNAs表达谱与转录组数据。3.取40例凶险性前置胎盘患者的胎盘,通过RealTime PCR、western blot等技术检测胎盘中miR-193a-3p和EFNB2表达情况及它们的相关性。利用生物信息学软件预测miR-193a-3p与EFNB2的结合位点,构建EFNB2野生型与突变型荧光素酶载体,应用双荧光素酶报告基因实验验证EFNB2是miR-193a-3p的靶基因。选取HTR-8/SVneo人绒毛外滋养细胞作为研究对象,将其培养于原代子宫内膜基质细胞的条件培养基中,在细胞中分别转染miR-193a-3p的模拟物、抑制物及各自对应的阴性对照序列,应用Transwell迁移及侵袭实验检测miR-193a-3p对HTR-8/SVneo细胞迁移及侵袭能力的影响。通过Real-Time PCR和western blot检测miR-193a-3p对HTR-8/SVneo细胞中EFNB2表达的影响。在细胞中沉默表达EFNB2以模拟miR-193a-3p的作用,应用Transwell迁移及侵袭实验检测EFNB2对HTR-8/SVneo细胞迁移及侵袭能力的影响。通过Real-Time PCR和western blot检测HTR-8/SVneo细胞中EFNB2的表达变化。为探究影响HTR-8/SVneo细胞迁移及侵袭的机制,经过上述转染后,利用western blot检测E-cad、N-cad、Vimentin、MMP2和MMP9的蛋白含量。结果:1.胎盘植入患者胎盘中microRNA表达谱分析,发现128个miRNAs在胎盘植入与非植入患者胎盘中存在差异性表达,其中,77个表达上调,51个表达下调。KEGG富集分析显示这些差异表达的miRNAs的靶基因在细胞粘连、细胞外基质受体相互作用通路和免疫相关通路富集。GO富集分析提示在生物学过程中,在生物学粘连、细胞聚集、细胞死亡等富集;在细胞组分中,主要富集于细胞连接、细胞外基质等部位;在分子功能中,与连接相关的分子富集明显。2.胎盘植入患者胎盘转录组测序分析,鉴定出37743个差异性表达的mRNAs。KEGG富集分析结果显示这些mRNAs主要参与Notch、PI3K/Akt、TNF、MAPK和mTOR等通路。GO富集分析发现在生物学过程中,主要在细胞粘连、细胞聚集、细胞增殖、应激反应等过程富集;而在分子功能中,与连接相关的分子富集明显。3.胎盘植入患者胎盘miRNAs表达谱与转录组联合分析,发现差异性表达miRNAs的靶基因与差异性表达转录组存在1044个交集靶基因,KEGG富集分析显示这1044个mRNAs在细胞粘连和免疫相关通路富集。GO富集分析提示在生物学过程中,在血管形成相关通路、细胞粘连、细胞交流等富集。转录组数据GSEA和GSVA分析证实胎盘植入胎盘存在血管形成不良与上皮间质转化通路异常。4.miR-193a-3p在胎盘植入组织中高表达而EFNB2低表达,两者的表达呈负相关。双荧光素酶实验提示EFNB2是miR-193a-3p的靶基因。提取的原代子宫内膜基质细胞具有典型的成纤维细胞形态,呈梭形,胞质内表达Vimentin蛋白。在子宫内膜基质细胞的条件培养基中,miR-193a-3p可促进HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭,而EFNB2抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭。对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的影响,可通过上皮间质转化通路而实现。在胎盘植入患者的胎盘组织、转染miR-193a-3p模拟物以及沉默表达EFNB2的细胞中,N-cad、Vimentin、MMP2和MMP9的表达上调而E-cad的表达下调。回复实验证实,miR-193a-3p通过抑制EFNB2的表达来促进HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭。结论:1.胎盘植入胎盘组织中差异性表达的miRNAs及其靶基因功能主要包括细胞连接、细胞聚集、细胞死亡、免疫系统反应等。2.胎盘植入胎盘组织中差异性表达的mRNAs的功能主要包括细胞连接、细胞聚集、细胞增殖、PI3K/Akt通路等。差异性表达miRNAs的靶基因与差异性表达转录组存在交集,这些靶基因在胎盘植入胎盘组织中参与血管形成相关通路与细胞粘连过程,且胎盘植入胎盘中存在血管形成不足和上皮间质转化异常。3.蜕膜缺陷时,miR-193a-3p通过负性调控EFNB2诱导上皮-间质转化促进HTR-8/SVneo细胞的迁移侵袭。