论文部分内容阅读
柑橘褐斑病(Alternaria brown spot,ABS)是由橘致病型链格孢菌(Alternaria alternata pathotype tangerine)导致的重要柑橘真菌病害之一。橘致病型链格孢菌主要危害敏感寄主的嫩叶、嫩梢和果实,严重时可造成柑橘品质下降,大量减产,导致柑橘产业损失惨重。目前柑橘褐斑病菌的基因组测序工作已经完成,有助于深入探究柑橘褐斑病菌的致病机理。蔗糖非发酵(Sucrose non-fermenting 1,SNF1)蛋白激酶复合体是一个对真菌生长发育和致病力至关重要且高度保守的异源三聚体蛋白,包含1个催化亚基α,2个调节亚基β、γ。前期研究表明,柑橘褐斑病菌的α亚基Snf1在碳源利用和致病性方面具有重要作用,另外2个亚基的生物学功能未曾报道。为了研究SNF1蛋白激酶复合体其他亚基在柑橘褐斑病菌中的功能,本研究通过BLASTP搜索,在柑橘褐斑病菌Z7菌株的基因组中找到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的β、γ亚基的同源基因Aa SIP2和Aa SNF4。利用生物信息学分析、实时荧光定量PCR、基因敲除技术和表型分析等方法,初步分析Aa SIP2和Aa SNF4在柑橘褐斑病菌生长发育及致病过程中的作用。获得的主要结果如下:1.根据柑橘褐斑病菌Z7菌株基因组注释信息可知:Aa SIP2 ORF长1 800 bp,编码600个氨基酸;Aa SNF4 ORF长1 086 bp,编码362个氨基酸。理化性质分析显示Aa Sip2蛋白的分子量为64.43 KD,PI为6.1,不稳定系数为53.90,总体平均疏水性为-0.734,为稳定的亲水蛋白;Aa Snf4蛋白的分子量为40.71 KD,PI为6.1,不稳定系数为35.01,总体平均疏水性为-0.162,为不稳定的亲水蛋白。二级结构分析表明,Aa Sip2蛋白主要以无规则卷曲为主,没有β-转角;而Aa Snf4蛋白主要以a-螺旋和无规则卷曲为主。Aa Sip2和Aanf4蛋白的氨基酸序列中均没有预测到跨膜结构域和信号肽,推测这两个蛋白不属于跨膜蛋白和分泌蛋白。亚细胞定位分析显示,Aa Sip2和Aa Snf4主要定位在细胞质,推测这两个蛋白可能主要在细胞质中发挥作用。系统发育分析表明,Aa Sip2和Aa Snf4蛋白与小麦黄斑叶枯病(Pyrenophora tritici-repentis)的蛋白在同一条分支上,表明它们的同源性最高,而与其他真菌的同源性较低。2.利用Split-marker基因敲除技术和PEG介导的原生质体遗传转化法,经潮霉素筛选、PCR及Southern blot验证,得到Aa SIP2和Aa SNF4基因敲除菌株。同时通过S.cerevisiae的高效同源重组机制构建基因功能回补质粒,转化突变体原生质体,经抗生素G418和PCR筛选,得到回补菌株CP-Si-4和CP-Sn-3。3.利用实时荧光定量PCR,分析Aa SIP2和Aa SNF4在致病过程和不同的碳源培养条件下的表达情况。研究结果表明,在柑橘褐斑菌侵染寄主的整个过程中,Aa SIP2和Aa SNF4基因持续表达,推测Aa SIP2和Aa SNF4基因均在柑橘褐斑病菌致病过程中发挥一定作用。此外,Aa SIP2和Aa SNF4基因在不同碳源培养条件下表达也有差异,在以麦芽糖为唯一碳源时表达量最高,蔗糖次之,Na AC最低,说明这2个基因在柑橘褐斑病菌选择性利用碳源方面具有一定作用。4.分析柑橘褐斑病菌野生型、基因突变体和回补菌株的表型差异,结果显示:Aa SIP2和Aa SNF4的缺失影响突变体的孢子形态、萌发及产孢,ΔAa Sip2和ΔAa Snf4的孢子变长,产孢量显著下降,孢子萌发速度明显减缓。ΔAa Sip2和ΔAa Snf4对糖和Ca Cl2、KCl胁迫更敏感;同时生长速度在不同单一碳源的MM培养基上受到不同程度抑制,尤其是在麦芽糖和蔗糖培养基上影响较大;突变体对寄主的致病能力也显著降低。