目的:本研究旨在通过网络药理学方法探索平喘颗粒抑制支气管哮喘气道上皮间质转化的作用机制,并通过动物实验对预测的机制进行验证。方法:1.采用网络药理学方法对平喘颗粒抑制支气管哮喘气道上皮间质转化的潜在作用机制进行分析,具体步骤如下:通过Drug Bank、OMIM和GeneCards数据库中获取的哮喘、气道重塑和上皮间质转化相关的靶点取交集,通过TCMSP、中国科学院化合物参考数据库检数据库获取平喘颗粒各化合物及其靶标基因,取交集得到平喘颗粒作用于本病的靶点,并构建平喘颗粒-疾病靶点的PPI网络,通过MCODE插件对平喘颗粒-疾病-靶点进行聚类分析。采用Autodock vina软件将平喘颗粒-疾病-靶点的Cluster 1聚类的13个炎症靶点与平喘颗粒的8个主要活性成分分别进行对接,验证平喘颗粒的活性成分是通过抑制炎症反应进而抑制上皮间质转化过程,从而完善平喘颗粒作用的物质基础。利用DAVID数据库对核心靶点进行GO、KEGG富集分析及GO enrichment plot可视化分析,得到参与平喘颗粒治疗哮喘气道上皮间质转化的信号通路。最后,对分析结果进行解析。2.基于网络药理学分析结果,设计动物实验进一步验证平喘颗粒抑制哮喘上皮间质转化的部分机制。实验:40只BALB/c小鼠被随机分为4组,每组10只,分别为空白组(NC组)、模型组(HDM组)、平喘颗粒组(PCG组)、布地奈德组(BUD组)。除NC组外,余下3组小鼠从第一天起采用HDM滴鼻法复制哮喘模型,每周连续5天进行10 μl HDM诱导液滴鼻,休息2天,连续诱导5周。各组小鼠在HDM诱导前1 h给予相应的药物进行干预,其中PCG组以平喘颗粒浓缩液(31.2g/kg/d)进行灌胃治疗,NC组、HDM组和BUD组小鼠给予等体积的生理盐水灌胃治疗。BUD小鼠于HDM诱导前1 h给予布地奈德(0.9%生理盐水2 ml+布地奈德雾化混悬液1 mg)雾化治疗,每次雾化20min,持续给予5周,日1次。各组小鼠于造模后的第34天(末次HDM诱导后24 h)行AHR检测,小鼠AHR检测24 h后,予3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射(30mg/kg)麻醉。观察指标:(1)检测各组哮喘小鼠气道高反应性;(2)HE染色、PAS染色、Masson染色法观察各组小鼠肺组织病理形态学变化;(3)ELISA法检测BALF及血清中IgE和IL-6浓度;(4)免疫组化、RT-PCR及Western blot法检测小鼠肺组织中 IL-6、α-SMA、E-cadherin 和 N-cadherin 蛋白及 mRNA 的表达水平;(5)免疫组化和Western blot检测小鼠肺组织中p-JAK2、p-STAT3、JAK2及STAT3的蛋白表达水平。探讨平喘颗粒抑制支气管哮喘气道上皮间质转化的作用机制。结果:1.共得到OB≥30%和DL≥0.18的平喘颗粒化合物115个及中药靶标蛋白257个,得到哮喘气道重塑与上皮间质转化的共同靶点958个,取交集得到120个平喘颗粒治疗疾病(哮喘-气道重塑-上皮间质转化)的靶点,并构建平喘颗粒-疾病-靶点可视化网络,得到排名前20位的靶点分别为:JUN、AKT1、RELA、MAPK1、MAPK3、TNF、HSP90AA1、IL-6、MAPK14、ESR1、RB 1、FOS、EGFR、RB 1、MAPK8、NR3C1、CXCL8、VEGFA、CDKN1A和C CND1。说明这些靶点在哮喘气道重塑与上皮间质转化的病理过程中发挥着重要的作用。利用Autodock vina软件将平喘颗粒-疾病-靶点的Cluster 1聚类的13个炎症靶点与2.4部分筛选得到的平喘颗粒的8个主要活性成分进行对接分析,得出平喘颗粒的8个主要活性成分与13个炎症靶点均有一定的结合活性,其中平喘颗粒的8个主要活性成分与IL-6作用的稳定性最佳。说明平喘颗粒可能是通过抑制炎症反应进而抑制上皮间质转化。DAVID数据库对Cluster 1的13个核心靶点进行生物信息学分析,可见平喘颗粒在治疗哮喘气道上皮间质转化的功效主要与分泌调节、细胞因子产生的正调控、急性炎症反应、急性期反应、MHC Ⅱ类生物合成过程的正调控等分子功能有关。通过K E G G富集分析得出平喘颗粒在治疗哮喘气道上皮间质转化的过程主要与Asthma、Fc-epsilon-RI信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路等信号途径有关。2.与NC组比较,HDM组气道高反应性升高,PCG组和BUD组哮喘小鼠的气道高反应性较HDM组均有所改善,且疗效相当(P>0.05)。3.HE染色:与NC组相比,HDM组哮喘小鼠气道管腔出现狭窄,黏膜明显水肿,腺体肥大,管壁及黏膜明显增厚,气道周围存在大量炎症细胞浸润。与HDM组相比,PCG组和BUD组上述病理特征减轻。PCG组和BUD组两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4.PAS染色:与NC组相比,HDM组小鼠肺组织可见气道黏液及杯状细胞明显增多;与HDM组相比,PCG组和BUD组黏液及杯状细胞明显减轻。PCG组和BUD组两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。5.Masson染色:NC组小鼠肺组织气道周围仅存在极少量的胶原纤维。与NC组相比,HDM组小鼠肺组织气道上皮下及血管周围存在大量胶原沉积,广泛分布于气道周围。PCG组和BUD组小鼠肺组织Masson染色后可见胶原沉积较HDM组减轻,差异具有统计学意义(P<0.05),而PCG组病理变化较BUD组减轻更为明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.ELISA法结果显示:模型组小鼠BALF及血清中IgE、IL-6水平较NC组明显升高(P<0.05);PCG组和BUD组小鼠BALF及血清中IgE、IL-6水平较HDM组明显降低(P<0.05);PCG组BALF及血清中IL-6明显低于BUD组,差异具有统计学意义(P<0.05)。7.免疫组化、Western blot及RT-PCR检测小鼠肺组织中IL-6、E-cadherin、N-cadherin及α-SMA的表达水平:与NC组相比,HDM组中IL-6、α-SMA、N-cadherin蛋白及mRNA的表达水平显著升高,E-cadherin蛋白及mRNA表达显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.01)。与HDM组相比,PCG组和BUD组IL-6蛋白及mRNA的表达水平均显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.01),PCG组和BUD组α-SMA和N-cadherin蛋白及mRNA表达显著降低,E-cadherin蛋白及mRNA表达显著增加,差异均具有统计学意义(PCG vs HDM P<0.01和BUD vs HDM P<0.05)。PCG组和BUD组组间比较,PCG组均明显优于BUD组,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.免疫组化和Western blot检测肺组织中JAK/STAT3信号通路中关键蛋白的表达水平:与NC组相比,HDM组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义(P<0.01),但HDM组JAK2和STAT3蛋白未见明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。与HDM相比,PCG组和BUD组p-JAK2和p-STAT3蛋白表达显著降低,差异均具有统计学意义(PCG vs HDM P<0.01 和 BUD vs HDM P<0.05)。PCG 组和 BUD 组组间比较,PCG组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达明显低于BUD组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.本研究采用网络药理学方法分析得到平喘颗粒通过多通路、多靶点干预哮喘上皮间质转化,其药理机制可能是通过作用于IL-6介导的JAK2/STAT3信号通路,抑制炎症反应,进而抑制哮喘上皮间质转化,减缓气道重塑进程。2.平喘颗粒能够减轻哮喘小鼠气道高反应性、气道炎性细胞浸润、杯状细胞增生、气道胶原沉积、管壁厚度的病理变化,抑制哮喘气道重塑形成。3.平喘颗粒可以降低哮喘小鼠血清及BALF中IgE、IL-6水平,降低肺组织中 IL-6、α-SMA、N-cadherin 蛋白及 mRNA 表达,增加 E-cadherin 蛋白及mRNA表达,降低p-JAK2、p-STAT3蛋白表达。4.平喘颗粒通过抑制IL-6介导的JAK2/STAT3信号通路的激活,抑制炎症反应,从而抑制哮喘上皮间质转化,减轻气道重塑。