为了进一步探索建立稳定、有效、经济的猪胚胎体外生产方案,为猪克隆平台的优化提供依据。本研究针对影响猪胚胎体外生产效率的部分关键环节,重点了研究如何提高猪卵母细胞体外成熟质量、优化猪胚胎体外培养条件。研究了不同电击活参数,必需氨基酸和非必需氨基酸对猪卵母细胞体外成熟与成熟后孤雌发育的影响;探索了Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎体外发育的影响;比较了在体外培养过程中添加丙戊酸对猪克隆胚的影响。(1)将经过体外成熟的卵母细胞随机分别以1.56 kv/cm、100μs、2DC;1.56 kv/cm、100μs、1DC;1.00 kv/cm、80μs、2DC三组参数进行电激活,发现经1.00 kv/cm、80μs、2DC电激活的卵母细胞,无论是胚胎的卵裂率还是囊胚率都低于1.56 kv/cm、100μs、2DC和1.56 kv/cm、100μs、1DC电激活的组(卵裂率65.77±0.31% vs. 78.90±0.19%、77.78±0.18%, P<0.05;囊胚率27.71±0.39% vs. 39.98±0.38%、36.55±0.25%, P<0.05)。(2)为了探讨瘦素(Leptin)对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后胚胎早期发育的影响,本研究选择在Earle’s盐缓冲的TCM199中添加10 IU/mL PMSG,10 IU/mL hCG,10 ng/mL EGF配制成化学限定的基础液,添加不同浓度Leptin对猪卵母细胞进行体外成熟培养为各试验组,以未添加Leptin的基础液为对照组1,而添加5%的胎牛血清(FBS),10%猪卵泡液为对照组2。比较分析各组卵母细胞核成熟效率,孤雌激活后胚胎的卵裂率,囊胚发育率,结果表明,各添加组卵母细胞成熟率与对照组之间无显著差异(P>0.05);孤雌激活后,各组间的卵裂率和囊胚发育率也无明显差异。( 3 )以不同浓度必需氨基酸和非必需氨基酸( 1%EAA+1%NEAA ,2%EAA+1%NEAA)添加到猪卵母细胞IVM培养液,发现无论是成熟率还是孤雌激活后的卵裂率,实验组与对照组都没有显著差异(P>0.05);而胚胎的后期培养上,发现添加组(1%EAA+1%NEAA,2%EAA+1%NEAA)的囊胚率要显著低于对照组1和2(19.07±3.15% ,16.89±2.41% vs.26.53±2.00% ,27.55±1.64%,P<0.05)。(4)在胚胎培养液PZM-3和PZM-4中分别添加不同浓度的瘦素(10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL)发现处理组胚胎发育情况均优于对照组,尽管在卵裂率和囊胚细胞总数上没有显著差异,但在囊胚率方面,发现无论是PZM-3还是PZM-4添加组都比对照组要高,且差异显著(P<0.05),而且相对于对照组,添加50ng/mL的组囊胚率最高(PZM-3,51.23±3.48% vs. 34.37±4.03%,P<0.05;PZM-4,31.76±5.07% vs. 12.14±1.89%,P<0.05)。(5)在胚胎培养液PZM-3中添加不同浓度的VPA,发现添加组的卵裂率与对照组没有显著差别(P>0.05);而添加组胚胎的后期均不能发育到囊胚。结果表明:①用1.56 kv/cm、100μs、2DC作为孤雌激活的电击活参数效果最好。②在成熟液中添加Leptin对卵母细胞成熟作用不明显,也没有显著提高后期胚胎发育的能力。③在成熟液中添加必需氨基酸和非必需氨基酸对于卵母细胞的成熟并不影响,但对孤雌激活胚的后期发育不利,囊胚率显著降低。④在胚胎培养液中添加Leptin对胚胎发育有促进作用,添加50ng/mL和100ng/mL能显著提高囊胚率,且添加50ng/mL囊胚率最高。⑤在胚胎培养液中添加全程VPA对重构胚胎的发育不利,不能发育到达囊胚期。综上所述,在猪卵母细胞的体外培养过程中,利用1.56 kv/cm、100μs、2DC的电击活参数,激活后在PZM-3胚胎培养液中添加50ng/mL Leptin,使得猪的胚胎在体外培养过程中可以获得较好的发育能力。