近年来,随着工农业的迅猛发展,大量污染环境和危害人类健康的化学污染物被不断地释放到环境中。其中酚类环境污染物及其衍生物化学性质稳定、难降解,易进入生物体内,干扰正常的生理活动,对动物的生殖内分泌系统产生不良影响。研究表明,双酚A（bisphenol-A,BPA）可导致脊椎动物生殖功能下降,生殖异常和扰乱正常内分泌功能。同时,关于酚类物质干扰动物类固醇激素合成中的关键酶有很多报到,但是有关BPA对中国林蛙类固醇激素合成中芳香化酶和StAR的研究却很少。本实验以中国林蛙（Rana chensinensis）为研究对象,探讨BPA对中国林蛙精巢间质细胞中CYP19 mRNA、芳香化酶（P450arom）和StAR表达的影响,旨在揭示酚类环境化学污染物影响两栖类动物内分泌的机制,为由BPA污染所造成的两栖类繁殖能力下降提供一定的理论依据。本实验以雄性中国林蛙为实验动物,将中国林蛙暴露于10^-7、10^-6、10^-5M BPA水体中持续10d、20d、30d;以10^-8、10^-9M 17β-雌二醇（17β-estradiol,E₂）作为阳性对照,取其精巢组织,用原位杂交方法检测CYP19 mRNA的表达,用免疫组织化学方法检测P450arom和StAR的表达。实验结果及结论如下:1.总RNA提取之后,测定RNA OD值,得到OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.9和2.2之间。经电泳检测,出现28S、18S、5S三条带,说明样品纯度合格。成功扩增了322bpCYP19基因cDNA序列,经测序与美洲豹蛙（Rana pipiens）P450arom mRNA相似性为96%,与粗皮蛙（Ranarugosa）P450arom mRNA相似性为95%,初步确定所获序列为CYP19基因cDNA序列的一个片段。将该片段成功转化后提取质粒测序,结果确定插入片段为目的片段,将质粒线性化后,成功合成RNA探针。2.用合成的探针进行原位杂交反应,检测BPA、E₂处理组和对照组中国林蛙精巢中CYP19mRNA的表达,结果在间质细胞和支持细胞中均有CYP19 mRNA阳性反应,胞质内有蓝紫色颗粒。CYP19 mRNA阳性信号主要在间质细胞中表达,支持细胞中仅有少量表达。间质细胞中CYP19 mRNA的表达相对值统计分析结果可见,在10^-5M、10^-7M BPA处理组中,随BPA处理时间不同CYP19 mRNA表达相对值变化不显著。在10^-6M BPA、10^-8M E₂浓度组中,随BPA、E₂处理时间不同CYP19 mRNA表达相对值均高于对照组,其中当BPA、E₂处理20d时,CYP19 mRNA表达相对值达到最大。在10^-9M E₂浓度组中,CYP19 mRNA表达相对值高于对照组,随E₂处理时间的增加CYP19 mRNA表达相对值增加,CYP19 mRNA表达相对值随处理时间上调。在处理时间相同时,当BPA浓度为10^-6、10^-7M,E₂浓度为10^-8、10^-9M时CYP19 mRNA表达相对值随浓度增大而增加。表明间质细胞中CYP19 mRNA表达量与BPA的累积剂量有关,CYP19 mRNA分子表达量与BPA之间有剂量-时间效应关系。3.用免疫组织化学方法检测精巢中P450arom的表达,P450arom阳性反应主要在间质细胞。统计分析间质细胞中的P450arom的表达相对值,在10^-5M、10^-7M BPA处理组中,随BPA处理时间不同P450arom表达相对值变化不显著。在10^-6M BPA、10^-8M E₂处理组中,随BPA、E₂处理时间不同P450arom表达相对值均高于对照组,其中当BPA、E₂处理20d时,P450arom表达相对值达到最大。在10^-9M E₂浓度组中,P450arom表达相对值高于对照组,随E₂处理时间的增加P450arom表达相对值增加,P450arom表达相对值随处理时间上调。在处理时间相同时,当BPA浓度为10^-6、10^-7M,E₂浓度为10^-8、10^-9M时P450arom表达相对值随浓度增大而增加。表明间质细胞中P450arom表达量与BPA的累积剂量有关,P450arom蛋白表达量与BPA之间有剂量-时间效应关系。这些结果与CYP19 mRNA原位杂交结果基本一致。4.用免疫组织化学法检测精巢中StAR的表达,StAR阳性反应主要在间质细胞。统计分析间质细胞中的StAR的表达相对值,结果与P450arom免疫组织化学反应结果相似。但不同的是,在10^-5M BPA处理组中,随BPA处理时间不同StAR表达相对值变化显著,其中,当BPA处理10d时StAR表达相对值较对照组降低,StAR表达下调。表明间质细胞中StAR表达量与BPA的剂量有关,StAR蛋白表达量与BPA之间同样有剂量-时间效应关系。5.本实验中E₂作为BPA的一个阳性对照,处理结果显示,10^-8M E₂浓度组中,随E₂处理时间不同CYP19 mRNA、P450arom、StAR表达相对值显著高于BPA处理组。显示雌激素活性E₂＞BPA。上述结果表明,BPA能够影响中国林蛙精巢间质细胞中类固醇激素合成中的关键性酶P450arom、StAR的表达。提示BPA通过调控P450arom、StAR的表达来干扰动物的内分泌活动。